人前列腺癌细胞株核酸适配体筛选及初步应用研究

发布时间：2017-09-11 23:08

  本文关键词：人前列腺癌细胞株核酸适配体筛选及初步应用研究

  更多相关文章： Cell-SELEX 前列腺癌 核酸适配体 PC-3M-1E8细胞株

【摘要】：前列腺癌(Prostate Carcinoma,PCa)是一种严重威胁男性健康的常见恶性肿瘤,其发病率位居全球男性恶性肿瘤的第二位,近年来,其发病率在全球仍在急剧增加。前列腺癌的早期发现及早期治疗,可以极大提高患者的治愈率,有效延长患者的寿命。目前,针对前列腺癌的早期诊断方法主要是建立在直肠指检、影像学检查、肿瘤标记物检查和穿刺活检等基础上,存在发现不及时、检测范围局限、易损伤正常组织、易与其它病症相混淆等缺陷,难以对前列腺癌实现早期诊断。因此,筛选获取一种特异性前列腺癌细胞的新型分子识别探针,建立一种简单、迅速、灵敏、特异性强的分子识别早期诊断技术,对前列腺癌的早期诊断和早期治疗具有非常重要的意义。Cell-SELEX技术是近年发展起来的以完整肿瘤细胞为靶标的筛选技术,能从不同类型肿瘤细胞或正常细胞中筛选获得特异性识别靶细胞的核酸适配体探针,筛选得到的核酸适配体可结合天然状态的靶分子,直接用于识别、检测细胞,对癌症早期诊断和分型、肿瘤标记物的发现及肿瘤的发生与发展机制的研究提供了新的契机,在生物医学领域发挥着非常重要的作用。本文基于Cell-SELEX技术,以人前列腺高转移癌为靶细胞,人前列腺低转移癌为对照细胞,在未知细胞表面靶标的情况下,筛选出一种能高亲和力高特异性识别人前列腺癌细胞株的核酸适配体。具体内容如下:1.人前列腺癌PC-3M-1E8细胞株核酸适配体的筛选以人前列腺高转移癌PC-3M-1E8细胞株为靶细胞,人前列腺低转移癌PC-3M-2B4细胞株为对照细胞,利用Cell-SELEX技术,通过增加洗涤次数,增加反筛细胞数量等手段,不断提高筛选过程中的筛选压力,从而提高筛选的效率,最后经过12轮筛选,获得了饱和富集筛选文库。通过对筛选文库克隆测序和同源性分析,获得了4条能够同时结合PC-3M-1E8和PC-3M-2B4两细胞株的核酸适配体。2.人前列腺癌细胞株核酸适配体的性质考察及初步应用研究随后对所获得的核酸适配体进行了性质分析研究,通过流式细胞术考察了细胞特异性、平衡解离常数、温度稳定性等。实验结果表明,核酸适配体具有特异性强、亲和力高、温度稳定性好等特点。另外,还运用Mfold软件分析了核酸适配体的二级结构,根据二级结构的分析结果进行序列结构的优化,得到一条仅有51 nt的优化后序列C1,其平衡解离常数约为10 n M;以及经蛋白酶处理后,根据核酸适配体与细胞的结合情况,初步推测细胞表面的靶分子很可能是一种膜蛋白,为后续前列腺癌细胞表面的特异性肿瘤标记物的研究与钓取奠定了实验基础,并有望应用到前列腺癌的早期诊断治疗中。
【关键词】：Cell-SELEX 前列腺癌 核酸适配体 PC-3M-1E8细胞株
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 本文所用英文缩略词表11-12
• 第1章 绪论12-31
• 1.1 前列腺癌12-16
• 1.1.1 前列腺癌的概述12-14
• 1.1.2 前列腺癌的诊断研究进展14-16
• 1.2 SELEX技术16-22
• 1.2.1 SELEX技术简介16-18
• 1.2.2 SELEX技术的发展现状18-22
• 1.3 核酸适配体在肿瘤细胞检测及成像中的应用22-29
• 1.3.1 核酸适配体性质22-23
• 1.3.2 核酸适配体在肿瘤细胞检测中的应用23-26
• 1.3.3 核酸适配体在肿瘤细胞成像中的应用26-29
• 1.4 本论文拟开展的工作29-31
• 第2章 人前列腺癌细胞株核酸适配体的筛选31-53
• 2.1 前言31
• 2.2 实验部分31-41
• 2.2.1 试剂和仪器31-34
• 2.2.2 溶液的配制34
• 2.2.3 细胞的培养、传代及细胞悬液的配置34-35
• 2.2.4 PCR条件的优化35-36
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳及成像36-37
• 2.2.6 前列腺癌细胞株核酸适配体的筛选37-40
• 2.2.7 筛选进程的监测40
• 2.2.8 克隆测序及序列分析40
• 2.2.9 序列特异性考察40-41
• 2.2.10 序列亲和力考察41
• 2.2.11 激光共聚焦验证41
• 2.3 结果与讨论41-52
• 2.3.1 引物的设计及PCR条件的优化41-43
• 2.3.2 筛选条件的选择43-44
• 2.3.3 筛选过程的表征44-45
• 2.3.4 筛选文库的进化表征及终点判断45-47
• 2.3.5 克隆测序结果及序列分析47-49
• 2.3.6 核酸适配体的特异性考察49-50
• 2.3.7 核酸适配体的亲和力考察50-52
• 2.3.8 激光共聚焦验证结果52
• 2.4 小结52-53
• 第3章 人前列腺癌细胞株核酸适配体的性质考察及初步应用研究53-60
• 3.1 前言53
• 3.2 实验部分53-55
• 3.2.1 试剂和仪器53-54
• 3.2.2 优化后序列的性质考察54
• 3.2.3 温度对核酸适配体结合能力的影响54-55
• 3.2.4 酶对核酸适配体结合情况的影响55
• 3.3 结果与讨论55-59
• 3.3.1 核酸适配体的序列优化55-56
• 3.3.2 优化后序列的性质考察56-58
• 3.3.3 温度对核酸适配体结合能力的影响58
• 3.3.4 酶对核酸适配体结合情况的影响58-59
• 3.4 小结59-60
• 结论60-61
• 附篇 基于GO-淬灭的荧光aptasensor用于肝癌细胞SMMC-7721的高灵敏检测61-68
• 1.1 前言61
• 1.2 实验部分61-63
• 1.3 结果与讨论63-67
• 1.4 小结67-68
• 参考文献68-75
• 附录A 攻读硕士学位期间所发表的学术论文75-76
• 致谢76-77

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本文编号：833604