CTP-NPRL2融合蛋白对肾癌原代细胞迁移侵袭能力的抑制及机制研究

发布时间：2017-09-21 01:38

  本文关键词：CTP-NPRL2融合蛋白对肾癌原代细胞迁移侵袭能力的抑制及机制研究

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【摘要】：目的将原核表达的氮酶调节因子2(nitrogen permease regulator 2-like,NPRL2)融合蛋白通过胞浆转导肽(cytoplasmic transduction peptide,CTP)转入肾癌原代细胞内,观察其对肾癌原代细胞迁移侵袭的影响,并分析与肾癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系。方法胶原酶消化法培养肾癌原代细胞;构建原核表达质粒pET15b-CTP-NPRL2和pET15b-NPRL2,表达融合蛋白CTP-NPRL2和NPRL2,并通过Western blot鉴定目的蛋白的表达。将培养成功的原代细胞分为BLANK组、NPRL2组和CTP-NPRL2组。免疫荧光检测目的蛋白的细胞定位;Transwell迁移侵袭实验检测导入NPRL2蛋白后,对肾癌细胞迁移侵袭能力的影响;Real-time PCR检测Raptor、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤粘蛋白(Fibronectin)m RNA表达水平;Western blot检测Raptor、E-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表达水平。结果成功培养出肾癌原代细胞并通过鉴定;测序结果及Western blot检测结果显示质粒构建成功并表达出目的蛋白;免疫荧光检测结果显示CTP-NPRL2融合蛋白可以穿过胞膜并定位于胞浆;迁移和侵袭实验显示CTP-NPRL2组肾癌细胞迁移侵袭能力明显下降(P0.05);Real-time PCR和Western blot检测结果显示CTP-NPRL2组Raptor、Vimentin与Fibronectin的m RNA、蛋白表达水平与NPRL2组和BLANK组相比明显降低(P0.05),而E-cadherin的mRNA、蛋白表达水平与NPRL2组与BLANK组相比明显升高(P0.05)。结论 NPRL2可能通过与Raptor相互作用影响mTORC1的活性,进而调节EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、Fibronectin的表达量,影响肾癌细胞的迁移侵袭能力。
【作者单位】： 重庆医科大学附属第一医院泌尿外科;
【关键词】： NPRL mTORC 迁移 侵袭 上皮间质转化
【基金】：[基金项目]重庆市科学技术委员会应用开发(CSTC2013yykfA 110004)~~
【分类号】：R737.11
【正文快照】： 院泌尿外科)confirmed the successful culture of primary RCC cells derived from patient specimens.After plasmidconstruction and transfection,the expression of fusion proteins CTP-NPRL2 and NPRL2 were detected byWestern blotting.Green fluorescence was only ，

本文编号：891656