miR-218抑制前列腺肿瘤病理细胞PC-3的增殖及去SUMO化酶SENP1的表达

发布时间：2017-09-21 20:22

  本文关键词：miR-218抑制前列腺肿瘤病理细胞PC-3的增殖及去SUMO化酶SENP1的表达

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【摘要】：micro RNAs是由21 23个核苷酸组成的高度保守的非编码RNA,它通过与特定m RNA的未翻译区结合负调节靶基因表达,研究表明microRNA异常表达与肿瘤的发生发展密切相关。类泛素修饰是人类体内的重要生理过程,是人类的生理和病理反应所必须的生理反应。类泛素化蛋白酶1(SENP1),它帮助SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3成熟并可以使得SUMO修饰后的蛋白质去修饰。mi R-218是已报道的肿瘤抑制基因,在前列腺肿瘤细胞中目前没有研究证实mi R-218和SUMO化修饰之间的关系。本研究主要研究miR-218对基因SENP1的作用和对PC-3细胞增殖的影响作用,获得以下结论:1通过软件预测和实验验证,筛选出基因miR-218与基因SENP1有一定数量的碱基配对,成功构建质粒miR-218和miR-NC。经质粒PCR、双酶切以及测序鉴定正确后。同时在前列腺肿瘤细胞中miR-218的高水平表达。2通过实验验证,miR-218能够调控基因SENP1。miR-218可以通过与去SUMO化酶SENP1基因的3’UTR区域相结合抑制SENP1基因的表达,并且通过qPCR验证了miR-218对基因BMI、LAMB3和SENP1有着下调的作用。3通过实验发现miR-218可以提高SUMO修饰蛋白的水平。基因SENP1是去SUMO化途径中的重要蛋白,miR-218对基因SENP1有着抑制作用,因此,miR-218可以增加导致SUMO修饰蛋白的累积。本研究中miR-218可以在PC-3细胞中下调SENP1的表达,并且影响类泛素化途径中相关蛋白的表达量,从而抑制前列腺癌细胞PC-3的增殖,为后续深入研究前列腺肿瘤细胞中SUMO修饰与肿瘤的关系奠定基础。
【关键词】：miR-218 SUMO 前列腺癌 SENP1
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-10
• 第一章 文献综述10-21
• 1.1 前列腺癌的研究概况和现状10-12
• 1.1.1 前列腺癌的现状10
• 1.1.2 前列腺癌的危险因素10-11
• 1.1.3 三种常见的前列腺肿瘤病理细胞系11-12
• 1.2 microRNA与前列腺癌12-13
• 1.3 SUMO化修饰的相关研究13-18
• 1.3.1 sumo化修饰的概念13-14
• 1.3.2 SUMO化修饰的过程14-15
• 1.3.3 SUMO化修饰的酶15-16
• 1.3.4 SUMO化修饰的生物学功能16-17
• 1.3.5 SUMO化与肿瘤的关系17-18
• 1.4 SENP的研究进展18-19
• 1.4.1 SENP-1 与雄激素受体AR18-19
• 1.4.2 SENP-1 与原癌基因c-Jun19
• 1.5 miR-218的研究进展19-20
• 1.5.1 miR-218与髓母细胞瘤19
• 1.5.2 miR-218与胃肠间质瘤19-20
• 1.5.3 miR-218与恶性胶质瘤20
• 1.6 研究意义与目的20-21
• 第二章 靶向SENP1的microRNA筛选及相关质粒的构建21-33
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 实验所用软件21
• 2.1.2 细胞及质粒21
• 2.1.3 试剂及仪器21
• 2.1.4 主要实验试剂的配备21-22
• 2.2 实验方法22-27
• 2.2.1 细胞复苏22
• 2.2.2 细胞培养22-23
• 2.2.3 细胞传代培养23
• 2.2.4 细胞冻存23
• 2.2.5 RNA抽提及microRNA实时定量检测23-24
• 2.2.6 质粒构建24-27
• 2.3 结果及分析27-32
• 2.3.1 软件Pic Tar、miRanda和Target Scan筛选miR-21827-29
• 2.3.2 miR-218基因克隆29
• 2.3.3 psl4-miR-218质粒的菌落PCR验证29-30
• 2.3.4 psl4-miR-218质粒的酶切验证30
• 2.3.5 psl4-miR-218质粒细胞学验证30-31
• 2.3.6 psicheck-senp1菌落PCR31
• 2.3.7 psicheck-senp1双酶切实验31-32
• 2.4 讨论32-33
• 第三章 靶向SENP1基因的miR-218的验证33-45
• 3.1 实验材料33
• 3.1.1 细胞33
• 3.1.2 试剂33
• 3.2 实验方法33-39
• 3.2.1 细胞转染实验33-34
• 3.2.2 细胞活性检测34
• 3.2.3 细胞增殖-毒性检测34
• 3.2.4 senp13’UTR的克隆及突变34-35
• 3.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-218对senp13’UTR序列的作用35-36
• 3.2.6 细胞克隆实验36-37
• 3.2.7 qPCR实验37-38
• 3.2.8 Western blot检测miR-218对SENP1蛋白表达的影响38-39
• 3.3 实验结果39-43
• 3.3.3 miR-218在PC-3 细胞中调节SENP1等相关基因的mRNA量41
• 3.3.4 miR-218影响SUMO化修饰的相关蛋白41-42
• 3.3.5 miR-218影响PC-3 细胞增殖42-43
• 3.4 讨论43-45
• 3.4.1 miR-218影响前列腺癌细胞PC-3 的细胞活性和增殖能力43-44
• 3.4.2 miR-218通过调节基因SENP-1 的表达从而影响细胞的增殖能力44
• 3.4.3 miR-218下调基因SENP-1 的表达44
• 3.4.4 miR-218影响细胞中SUMO相关蛋白44-45
• 参考文献45-48
• 致谢48-49
• 作者简介49

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本文编号：896669