自噬参与胰岛素抵抗介导的足细胞损伤
本文关键词：自噬参与胰岛素抵抗介导的足细胞损伤
【摘要】：目的：在全世界范围内,糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)已经成为引起终末期肾脏病的一个首要原因。糖尿病肾病是糖尿病的一个严重并发症,大约超过40%的2型糖尿病患者会出现这一并发症。以往的研究表明,胰岛素抵抗是糖尿病及其并发症的发病原因和病程进展中的一个关键性因素。在糖尿病肾病领域,肾脏足细胞是肾小球当中的胰岛素信号反应细胞,失去胰岛素敏感性的肾脏足细胞即使在正常的血糖条件下也会出现蛋白尿的表现,这说明足细胞中的胰岛素信号对于正常肾小球的功能是必不可少的。自噬是细胞内的一种分解代谢过程,它通过聚集和降解功能障碍的细胞器来维持细胞内环境稳态。自噬障碍与很多人类疾病密切相关,越来越多的证据表明调节白噬将会成为治疗糖尿病的一个新靶点。目前关于在胰岛素抵抗的足细胞中自噬过程是否发生改变仍旧是一个开放性的问题,而且关于自噬是否参与胰岛素抵抗介导的肾脏足细胞损伤也不明确。本研究旨在探讨：自噬在糖尿病肾病中的作用,并且主要着眼于自噬在发生胰岛素抵抗的肾脏足细胞中的作用。方法：1. 用shRNA慢病毒感染肾脏足细胞,改变胰岛素受体的表达,分别使用RT-qPCR及蛋白质免疫印记(Wesrern Blot)方法来验证敲除效率。2.敲除胰岛素受体后检测足细胞自噬水平：(1)蛋白质免疫印记(western blot)检测肾脏足细胞自噬水平的变化。200uM胰岛素分别刺激正常组,对照组,胰岛素受体敲除组,用Western Blot检测p62,Beclin;50um氯喹分别刺激或不刺激对照组,胰岛素受体敲除组,用Western Blot检测LC3的变化。(2)免疫荧光检测肾脏足细胞自噬水平的变化。200uM胰岛素分别刺激对照组,胰 岛素受体敲除组,用免疫荧光检测p62, Beclin及LC3的表达。(3)透射电镜检测肾脏足细胞自噬小体数量的变化。200uM胰岛素分别刺激对照组和胰岛素受体敲除组,利用电镜检测自噬小体的数量。3.敲除胰岛素受体后检测足细胞功能蛋白nephrin的变化：胰岛素刺激肾脏足细胞,检测nephrin蛋白的变化。200uM胰岛素分别刺激正常组,对照组,胰岛素受体敲除组,用western blot和免疫荧光检测nephrin蛋白的变化。4.应用雷帕霉素激活自噬后检测足细胞自噬水平和nephrin蛋白表达的变化。l0uM雷帕霉素刺激胰岛素受体敲除组,利用western blot检测p62和nephrin;50uM氯喹分别刺激或不刺激雷帕霉素处理组,利用western blot检测LC3。结果：1. 使用shRNA'慢病毒感染肾脏足细胞可以减少胰岛素受体的表达。(P0.05)2. 敲除胰岛素受体后自噬水平降低。(1)免疫印记表明敲除胰岛素受体的肾脏足细胞与对照组肾脏足细胞相比p62表达水平明显升高,而LC3和Beclinl的表达水平明显降低。(P0.05)(2)免疫荧光显示敲除胰岛素受体的肾脏足细胞与对照组肾脏足细胞相比p62表达水平升高,而LC3和Beclinl的表达降低。(3)透射电镜显示敲除胰岛素受体的肾脏足细胞与对照组肾脏足细胞相比自噬小体的数量明显减少。3. 免疫印记和免疫荧光都表明敲除胰岛素受体的肾脏足细胞与对照组肾脏足细胞相比nephrin的表达降低。4. 雷帕霉素刺激敲除胰岛素受体的肾脏足细胞与未加入雷帕霉素的敲除胰岛素受体的肾脏足细胞相比,自噬水平和nephrin的表达明显升高。(P0.05)结论：我们的结果表明当肾脏足细胞失去胰岛素敏感性时自噬水平会被抑制,并且会造成肾脏足细胞损伤;雷帕霉素作为mTOR抑制剂,可通过激活自噬改善胰岛素抵抗引起的肾脏足细胞损伤。
【关键词】：肾脏足细胞 胰岛素抵抗 自噬 糖尿病肾病
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：
- 中文摘要6-8
- 英文摘要8-11
- 符号说明11-13
- 前言13-16
- 材料与方法16-30
- 结果30-32
- 讨论32-34
- 结论34-35
- 附图35-41
- 参考文献41-46
- 致谢46-47
- 攻读学位期间发表的学术论文47-48
- 学位论文评阅及答辩情况表48
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本文编号：943003
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