晚期氧化蛋白产物通过内质网应激诱导肾小管上皮细胞肥大及转分化

发布时间：2017-10-02 01:00

  本文关键词：晚期氧化蛋白产物通过内质网应激诱导肾小管上皮细胞肥大及转分化

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【摘要】：慢性肾脏病(chronic kidney diseases, CKD)可导致终末期肾病(end-stage of renal disease, ESRD),是一个非常严重的全球性公共卫生问题。现已知肾脏纤维化主要由肾小球硬化和肾间质纤维化构成,而肾间质纤维化是各种CKD发展至终末期肾衰竭的主要病理基础和共同最后途径。近年来大量研究表明,肾功能的损害程度与肾小管间质病变的严重程度直接相关。由于肾小管间质体积大约占肾脏总体积的90%,故肾小管上皮细胞肥大为肾脏肥大的主要原因之一。已知健存肾单位代偿性肥大是慢性肾功能衰竭进行性发展机制的重要机制之一,代偿性肥大的肾小管上皮细胞出现高代谢,氧耗增加、氧自由基生成增多,进一步加重肾小管间质损伤；同时,肥大的肾小管上皮细胞通过分泌细胞因子、化学趋化因子、血管活性物质,表达粘附分子对肾细胞及单核／巨噬细胞的增生、分化、趋化起调节作用,并可转分化为成纤维细胞,直接促进肾脏纤维化的发生和慢性肾衰竭的进行性恶化。而且既往研究显示初期肾小管的适应性肥大将逐渐发展至适应不良,并导致肾小管萎缩及肾间质纤维化。综上可知,肾小管上皮细胞肥大与CKD发病机制密切相关。越来越多的研究表明,肾脏固有细胞如系膜细胞、肾小管上皮细胞等在炎症、损伤、缺氧等条件下可发生间质转分化,即失去其本身固有的细胞表型,转化成为肌成纤维细胞,进而导致肾间质的纤维化。尽管目前对肾小管上皮细胞转分化如何影响肾间质纤维化和促肾小管间质纤维化的细胞机制均存在争议,但许多研究表明肾小管上皮细胞间质转分化(epithelial-to-mesenchymal trasition, EMT)可导致肾间质纤维化,且EMT在CKD发病机理中始终起着重要的作用。因此,研究肾小管上皮细胞发生EMT的机制,阻断EMT的发生,对于干预CKD的进展具有十分重要的意义。晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AOPPs)是由血清蛋白与含氯氧化物在氧化应激过程中生成的一类含双酪氨酸的蛋白交联物,由Witko-Sarsat等于1996年首次报导。CKD患者体内早期即可检测到AOPPs明显增高,并且AOPPs的升高水平与肾功能损伤程度成正相关。此外,越来越多的证据也表明AOPPs可促进CKD的进展。已有研究报道AOPPs可诱导肾脏足细胞凋亡,肾小管上皮损伤,肾脏系膜细胞增生及分化。然而,尽管研究表明众多因素可诱导肾小管上皮细胞肥大及转分化,但AOPPs是否可引起肾小管上皮细胞肥大及转分化目前尚不清楚。内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)负责新生蛋白、分泌蛋白、膜相关蛋白的正确折叠和组装,是人体细胞主要的加工厂。各种因素(比如低氧环境)可引起ER功能紊乱,导致未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网膜腔内蓄积和Ca2+平衡紊乱,此类状态称之为内质网应激(ER stress, ERS)。ERS是细胞的一种自我保护机制,ERS发生未折叠蛋白反应时不仅能激活适应性通路又能激发凋亡通路。初期适度的ERS有助于增强细胞耐受应激刺激的能力,持续而严重的ERS则可能造成细胞的肥大、增生、分化甚至凋亡。如今ERS越来越受到广泛关注,ERS与多种肾脏疾病的发生发展密切相关,比如糖尿病肾病、毒物或药物引起的肾小管上皮细胞损伤、肾脏缺血再灌注损伤以及CKD等。现已有体外实验证明,AOPP可通过ERS诱导脂肪细胞炎症反应。但AOPPs是否可引起ERS及其如何通过内质网应激影响肾小管上皮细胞肥大和发生EMT仍需进一步研究。目前已有文献表明在CKD的发生发展过程中活性氧起着非常重要的作用,在CKD病人中,氧化应激状态的增高被认为是主要的致病因素之一。活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)能够诱导细胞出现增殖、肥大与凋亡等病理性改变。在正常生理环境下,肾脏自身会生成一些活性氧,包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。正常情况下,体内的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及维生素E等可以有效的清除这些活性氧。然而当体内活性氧的产生超过抗氧化系统负荷时,氧化应激就会造成组织的损害,所以活性氧的平衡对于肾脏组织的结构及其功能有着重要作用。已知氧化应激可激活内质网应激,但其是否参与AOPPs诱导的肾小管上皮细胞肥大及转分化尚需进一步研究。基于上述研究背景,本研究拟通过在体外条件下以AOPP培养人近端肾小管上皮细胞,检测细胞周期分布的相关变化,CHOP、GRP78、α-SMA、E-cadherin、p27的蛋白表达及mRNA的表达水平变化。经NADPH氧化酶抑制剂、活性氧抑制剂(SOD)、ERS抑制剂干预细胞后检测上述各项指标的变化。从而进一步探讨AOPP是否可通过内质网应激诱导肾小管上皮细胞肥大和转分化,以及氧化应激是否参与了该过程及与ERS的关系。本实验结果将为CKD的早期防治提供新的实验依据。一.研究目的本研究的主要目的是探讨AOPPs是否可导致肾小管上皮细胞肥大和发生EMT,并研究ERS是否是AOPPs诱导肾小管上皮细胞肥大和发生EMT的主要细胞内机制之一。此外,本研究还探讨了氧化应激是否参与了此过程及与ERS的关系。本研究的结果将为早期干预治疗CKD提供新的治疗靶点。二.研究方法1. AOPP的制备AOPPs牛血清白蛋白按文献报导配制。次氯酸溶液与血清白蛋白(BSA)以140/1的摩尔比例混合,于室温下(25～30℃)反应30分钟,以PBS透析24小时去除残留次氯酸。对照组未经修饰的牛血清蛋白直接融入PBS即可。所得样品用Detoxi-Gel凝胶柱去除内毒素。所有制备的AOPP经鲎试验法检测内毒素含量均低于0.25 EU/ml。AOPP含量的测定方法：在酸性条件下340nm处测定溶液的吸光度值,以氯胺T为标准取得。2.实验细胞：人近端肾小管上皮细胞株HK-2的培养HK-2细胞于美国ATCC库购买,在37℃、5%CO2条件下的含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养液中孵育。观察细胞长至80%以上融合时,以0.25%胰酶消化后接种至6孔培养板继续传代培养,待细胞长至70%-80%左右时用于后续实验。3. AOPP以浓度依赖的方式诱导肾小管上皮细胞肥大和发生EMT肾小管上皮细胞分别与50 μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml AOPPs共同孵育24小时,50μg/ml BSA作为阴性对照组,另设一组HK-2细胞作为空白对照。收集细胞样本,分别采用Western blot检测CHOP、GRP78、p27、α-SMA、 E-cadherin蛋白表达量及总蛋白含量,Real Time Quantitative PCR(RT-PCR)检测CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin的mRNA表达水平。使用流式细胞仪来分析细胞周期分布情况。4. AOPP以时间依赖的方式诱导肾小管上皮细胞肥大和发生EMT肾小管上皮细胞分别与200μg/ml AOPP、50μg/ml BSA孵育不同时间(30min、1h、3h、6h、12h、24h),收集细胞样本,采用Western blot检测CHOP、 GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白表达量及总蛋白含量,以RT-PCR检测CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin 的 mRNA表达水平。使用流式细胞仪来分析细胞周期分布情况。5.ERS在AOPP诱导的肾小管上皮细胞肥大和转分化中的作用分别以200μg/ml AOPPs、50μg/ml BSA、50μmol/L salubrinal (ERS抑制剂)、0.25μmol/L thapsigargin(ERS诱导剂)预处理肾小管上皮细胞1h后再加入200μg/ml AOPP刺激细胞,共同孵育24小时。收集各组细胞样本,采用Western blot和RT-PCR检测CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表达量,以流式细胞仪检测细胞周期。6.氧化应激在AOPP诱导的肾小管上皮细胞肥大和转分化中的作用分别以200μg/ml AOPPs、50lg/ml BSA、10μmol/L DPI (NADHP氧化酶抑制剂)或200U/ml SOD(氧自由基清除剂)预处理肾小管上皮细胞1h后再加入200μg/ml AOPP刺激细胞,共同孵育24小时。收集各组细胞样本,采用Westernblot和RT-PCR检测CHOP、GRP78、p27、α-SMA、E-cadherin蛋白及mRNA表达量,以流式细胞仪检测细胞周期。三.研究结果1. AOPP以剂量时间依赖方式诱导肾小管上皮细胞肥大本实验通过测定HK-2细胞内总蛋白含量研究AOPPs是否会引起肾小管上皮细胞肥大。实验结果表明AOPP刺激使HK-2细胞内总蛋白含量显著增加(Fig.1)。此外,本实验还检测了p27的蛋白及mRNA表达情况以及细胞周期分布情况。AOPPs刺激以剂量时间依赖性诱导p27蛋白(Fig.2, A B)及其基因(Fig.2,C＆D)过表达,同时使得G1期细胞(Fig.2 EF)百分比增加。尽管AOPP刺激组细胞培养24h后,细胞内p27蛋白表达量、总蛋白含量、G1期细胞数量均未达到最高值,但其表达水平均显著高于对照组(p0.05)。并且上述改变在对照组和未经修饰的BSA组均未观察到。这些实验结果表明：p27蛋白过表达、总蛋白蓄积、G1期细胞百分比增加均与血清蛋白的晚期氧化有关。简言之,本实验通过观察AOPPs引起p27过表达及G1期细胞百分比增加,说明AOPPs可诱导肾小管上皮细胞肥大。2. AOPP以剂量时间依赖方式诱导肾小管上皮细胞转分化本实验通过检测E-cadherin和α -SMA蛋白及mRNA的表达来观察AOPPs是否可引起肾小管上皮细胞转分化。E-cadherin蛋白和mRNA的表达随着AOPP刺激浓度的增高和时间的延长而下调,a-SMA蛋白和mRNA的表达则随着AOPP刺激浓度的增高和时间的延长而上调(Fig.3)。AOPP刺激诱导α-SMA的mRNA表达水平在12h时上升达最高峰,24h时下降,但其表达水平始终显著高于对照组(P0.05)。对照组和未经修饰的血清蛋白(BSA)组,E-cadherin和α-SMA蛋白表达水平无明显改变,这说明E-cadherin蛋白丢失和α-SMA蛋白过表达均与血清蛋白的晚期氧化相关。综上可知,AOPPs可引起肾小管上皮细胞转分化。3. AOPP诱导肾小管上皮细胞发生内质网应激反应本实验通过RT-PCR法和western-blot法检测GRP78和CHOP蛋白及mRNA表达水平,研究AOPPs刺激是否可引起内质网应激的发生。与对照组和未修饰BSA组相比,AOPPs刺激组GRP78和CHOP蛋白及其mRNA表达水平均显著增高(Fig.4)。尽管AOPP刺激组GRP78和CHOP蛋白及mRNA表达水平未在24h达最大值,但其表达水平始终明显高于对照组。以上数据说明AOPPs可诱导肾小管上皮细胞发生内质网应激。4. AOPP通过内质网应激诱导肾小管上皮细胞肥大及转分化为了研究内质网应激在AOPP诱导的肾小管上皮细胞肥大及发生转分化中的作用,本实验在各组HK-2细胞内加入试剂如下：第一组为空白对照组,第二组为白蛋白对照组,第三组为200 μg/mLAOPPs刺激组,第四组为AOPPs+salubrinal(可激活eIF2 a,减轻细胞ERS)组,第五组为thapsigargin(细胞ERS诱导剂)组,经RT-PCR法和Western Blot法检测各组CHOP、GRP78、 p27、E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表达情况。AOPP在转录和翻译水平诱导CHOP, GRP78, p27和α-SMA蛋白过表达,抑制E-cadherin蛋白表达,上述现象经ERS抑制剂处理后可部分逆转,而ERS诱导剂则可直接诱导细胞上述现象的发生(Fig.5)。此外,ERS抑制剂可部分抑制AOPP诱导的肾小管上皮细胞G1期细胞百分比和总蛋白含量的增加,而ERS诱导剂则引起肾小管上皮细胞G1期细胞百分比和总蛋白含量的增加(Fig.6)。所以,本实验结果提示AOPP通过内质网应激诱导肾小管上皮细胞肥大及转分化。5.内质网应激与氧化应激相关为研究肾小管上皮细胞内质网应激过程中氧化应激的作用,本实验在各组HK-2细胞内加入试剂如下：第一组为空白对照组,第二组为白蛋白对照组,第三组为200 μg/mLAOPPs刺激组,第四组为AOPPs+DPI (NADPH氧化酶抑制剂)组,第五组为AOPPs+SOD(总的活性氧抑制剂)组,经RT-PCR法和Western Blot法检测各组CHOP、GRP78、p27、E-cadherin和α-SMA蛋白及mRNA表达情况。实验结果提示AOPP可下调E-cadher in的表达,NADPH氧化酶抑制剂和ROS抑制剂可部分逆转AOPP引起的HK-2细胞总蛋白含量和G1期细胞百分比的增加(Fig.6),同时也可抑制AOPP诱导的a-SMA.CHOP和GRP78的过表达(Fig.5)。综上所述,本实验结果提示氧化应激在内质网应激反应的上游或下游通路中起作用,并参与了AOPP诱导的肾小管上皮细胞肥大及转分化过程。四.研究结论本实验研究结果证实晚期氧化蛋白产物可通过内质网应激诱导肾小管上皮细胞肥大及转分化。此外,本实验结果提示了氧化应激反应也参与了AOPP诱导肾小管上皮细胞肥大和发生EMT的过程,且与ERS有关。本实验结果将为早期干预CKD的进展提供新的治疗靶点。
【关键词】：晚期氧化蛋白产物 肾小管上皮细胞 肥大 转分化 内质网应激
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-25
• 材料与方法25-51
• 实验结果51-72
• 讨论72-75
• 全文结论75-76
• 参考文献76-82
• 英文缩略词表82-84
• 攻读学位期间成果84-85
• 致谢85-86

【共引文献】

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本文编号：956624