HELQ对生殖细胞分化影响的研究

发布时间：2017-10-02 13:10

  本文关键词：HELQ对生殖细胞分化影响的研究

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【摘要】：依据世界卫生组织(WHO)评估,全球不孕不育的比例已经占到育龄夫妇的15%。而其中男性不育患者已经占据人类不孕不育患者总量的一半左右。利用干细胞结合基因编辑技术,建立体外生殖分化疾病模型来研究男性不育疾病的机制,将会有非常好的应用前景。HELQ,名为类似于POLQ的解旋酶(Helicase,POLQ-like),是一种DNA依赖性的ATP酶及DNA解旋酶,它在DSB(DNA Double-Strand Breaks)以及DNA链间交联(Inter-strand Cross Link,ICL)的修复过程中都发挥着重要作用。HELQ可以直接与RAD51的旁系同源复合物RAD51B/C/D,XRCC2以及DNA损伤相应激酶ATR作用。有研究表明,HELQ功能缺陷的小鼠出现类似唯支持细胞综合征(Sertoli Cell Only Syndronie,SCOS)表型,提示HELQ可能在性原细胞阶段或者原始生殖细胞阶段发挥作用。在本实验中,通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得能稳定传代的HELQ敲除的小鼠雄性胚胎干细胞系(Embryonic stem cell,ES)。免疫荧光染色结果显示敲除HELQ后,Oct3/4及Nanog的表达与对照组相比无明显差异,利用四倍体补偿实验证明胚胎干细胞的多能性不受影响,能够获得健康的四倍体小鼠子代。同时我们利用HELQ敲除的胚胎干细胞在特定的培养条件下继续进行体外分化,最终可以得到第二天(Day2)的上胚层类似细胞(Epiblast Like cells,Epi LCs)。通过免疫荧光染色及Real-time PCR分析,结果表明HELQ敲除的胚胎干细胞分化为上胚层细胞无明显异常。说明敲除该基因后不会影响胚胎干细胞的多能性及定向分化。因此,我们按照体外生殖细胞分化体系继续将上胚层类似细胞按照生殖细胞方向分化,通过流式分析可知敲除HELQ后,形成较低比例的Blimp1和Stella阳性细胞,其比例与对照组相比相差2-3倍,说明HELQ对生殖细胞的分化具有一定的影响作用。虽然并未对其影响原因做进一步的研究,但是这将对男性不育治疗提供更多的理论和技术支持,为干细胞的临床应用提供新的研究思路和重要依据。
【关键词】：HELQ 生殖细胞 胚胎干细胞 上胚层类似细胞 CRISPR-Cas9
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R698.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 前言10-21
• 1.1 HELQ的作用及研究进展10-11
• 1.2 生殖细胞的研究进程11-16
• 1.2.1 PGCs体内的发育历程11-12
• 1.2.2 PGCs形成的重要事件12-15
• 1.2.3 PGCs形成过程中表观遗传的重编程15-16
• 1.2.4 PGCs特化的信号通路16
• 1.3 生殖细胞体外分化的研究进展16-17
• 1.4 CRISPR-Cas9系统的介绍及应用17-19
• 1.5 研究目的及意义19-21
• 第二章 材料与方法21-32
• 2.1 实验材料21
• 2.1.1 动物21
• 2.2 实验主要试剂的配制21-22
• 2.3 方法步骤22-32
• 2.3.1 HELQ敲除ES细胞系的建立及鉴定22-25
• 2.3.2 CF1小鼠胎儿成纤维细胞的培养及制作饲养层细胞25-26
• 2.3.3 小鼠胚胎干细胞的培养及上胚层样细胞的分化26
• 2.3.4 小鼠HELQ~(-/-)四倍体的获得26-28
• 2.3.5 HELQ~(-/-) ES及EpiLCs多能性的检测28-30
• 2.3.6 PGCLCs 细胞的获得及流式分析30-32
• 第三章 实验结果32-39
• 3.1 建立HELQ敲除（HELQ~(-/-)）小鼠胚胎干细胞系32-33
• 3.2 小鼠HELQ~(-/-) ES细胞多能性的鉴定33-34
• 3.3 HELQ~(-/-) ES细胞向EpiLCs的定向分化及鉴定34-36
• 3.4 HELQ敲除后对PGCLCs的分化的影响及分析36-39
• 第四章 总结与讨论39-42
• 4.1 主要结论39
• 4.2 讨论39-42
• 参考文献42-51
• 研究生期间论文发表情况51-52
• 缩写表（中英文对照）52-53
• 致谢53

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本文编号：959767