酸性及碱性环境对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响

发布时间：2017-10-03 02:25

  本文关键词：酸性及碱性环境对慢性肾衰竭大鼠血管钙化的影响

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【摘要】：目的:心血管疾病(Cardiovascular Disease,CVD)是慢性肾脏病(Chronic Kidney disease,CKD)患者死亡的主要病因,血管钙化是CVD发生的重要危险因素。CKD患者的血管钙化主要表现为血管中膜钙化,其关键环节是血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)向成骨/成软骨样表型转化。以往研究发现,酸性及碱性环境可以调节成骨细胞和破骨细胞功能进而影响骨形成。CKD患者的血管钙化类似骨发育过程,因此我们推测,酸性及碱性环境是否可以通过影响VSMCs表型转化来影响血管钙化。为了探讨酸性及碱性环境对血管钙化的影响,本实验以慢性肾衰竭大鼠血管钙化和体外培养高磷诱导的VSMCs钙化为模型,观察酸性及碱性环境对血管钙化及Runt相关转录因子2(Runx2)表达的影响。方法:1实验动物体内实验:清洁级、健康、雄性、5周龄SD大鼠,于屏障环境中适应性饲养1周。体外实验:运用组织块贴壁法原代培养SD大鼠胸主动脉VSMCs。2实验分组体内实验:将33只SD大鼠按随机数字表法分为5组,即对照组(6只)、慢性肾衰竭组(6只)、慢性肾衰竭血管钙化组(7只)、酸干预组(7只)和碱干预组(7只)。用5/6肾切除术构建大鼠慢性肾衰竭模型,骨化三醇灌胃诱导大鼠血管钙化,饲饮NH4CL构建大鼠慢性代谢性酸中毒模型,腹腔内注射Na HCO3构建大鼠慢性代谢性碱中毒模型。体外实验:将VSMCs随机分为4组,即正常对照组、p H7.4+高磷组、p H7.1+高磷组和p H7.7+高磷组。正常对照组采用低糖DMEM加10%胎牛血清的培养基,将p H值调整为7.4,作为正常培养基进行培养;p H7.4+高磷组应用高磷培养基进行培养,即在正常培养基中加入10 mmol/L的β-甘油磷酸,并将p H值调整为7.4;p H7.1+高磷组在高磷培养基的基础上将p H值调整为7.1进行培养;p H7.7+高磷组则在高磷培养基的基础上将p H值调整为7.7进行培养。3大鼠主动脉血各项指标检测:抽取大鼠主动脉血检测血肌酐、尿素氮、p H值及HCO3-浓度,以判断大鼠慢性肾衰竭模型、酸中毒模型、碱中毒模型是否构建成功。4钙化检测:对大鼠胸主动脉血管采用von Kossa染色及邻甲酚酞络合酮比色法检测钙化情况。VSMCs的钙化通过茜素红染色及邻甲酚酞络合酮比色法来检测。5碱性磷酸酶(ALP)活性测定:各组VSMCs通过酶联免疫吸附法检测细胞ALP活性。6 Runx2表达情况:对大鼠胸主动脉血管应用免疫组织化学方法检测Runx2的表达。VSMCs运用RT-PCR和Western-blot方法检测Runx2的表达。7统计学方法:实验所取得的据数采用SPSS 17.0统计学软件进行分析,符合正态分布的计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较用SNK检验(Student-Newman-Keuls)。P0.05为差异有统计学意义。结果:1慢性肾衰竭大鼠模型的建立:与对照组比较,慢性肾衰竭组、慢性肾衰竭血管钙化组、酸干预组和碱干预组大鼠血肌酐、尿素氮水平均明显升高(P0.05);与慢性肾衰竭血管钙化组比较,酸干预组大鼠动脉血p H值和HCO3-含量均降低(P0.05),碱干预组大鼠动脉血p H值和HCO3-含量均升高(P0.05)。2酸性及碱性环境对慢性肾衰竭大鼠胸主动脉血管钙化的影响:von Kossa染色结果显示,慢性肾衰竭血管钙化组及碱干预组大鼠胸主动脉中膜可见大量棕黑色钙盐沉积,但对照组、慢性肾衰竭组和酸干预组大鼠胸主动脉均未发现棕黑色钙盐沉积;与慢性肾衰竭血管钙化组比较,碱干预组大鼠胸主动脉中膜棕黑色钙盐沉积明显增多。邻甲酚酞络合酮比色法检测钙含量结果显示,与对照组比较,慢性肾衰竭血管钙化组和碱干预组大鼠胸主动脉钙含量明显增高(P0.05);与慢性肾衰竭血管钙化组比较,酸干预组大鼠胸主动脉钙含量明显降低(P0.05),碱干预组大鼠胸主动脉钙含量明显增高(P0.05)。3酸性及碱性环境对慢性肾衰竭大鼠胸主动脉血管Runx2表达的影响:免疫组织化学结果显示,与对照组和慢性肾衰竭组比较,慢性肾衰竭血管钙化组和碱干预组大鼠Runx2免疫组化评分(6.31±1.32vs2.08±0.83,6.31±1.32vs3.27±1.08,9.15±1.38vs2.08±0.83,9.15±1.38vs3.27±1.08)有所升高,其差异均有统计学意义(P0.05);与慢性肾衰竭血管钙化组比较,酸干预组大鼠Runx2免疫组化评分(3.83±1.3vs6.31±1.32,P0.05)明显降低,碱干预组大鼠Runx2免疫组化评分(9.15±1.38vs6.31±1.32,P0.05)明显升高。4酸性及碱性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs钙化的影响:茜素红钙化染色结果显示,与正常对照组比较,p H7.4+高磷组及p H7.7+高磷组细胞钙化结节增多;与p H7.4+高磷组比较,p H7.1+高磷组细胞钙化结节减少,p H7.7+高磷组细胞钙化结节明显增多。邻甲酚酞络合酮比色法测定钙含量结果显示,与正常对照组比较,p H7.4+高磷组及p H7.7+高磷组细胞钙含量增加(P0.05);与p H7.4+高磷组比较,p H7.1+高磷组细胞钙含量减少,p H7.7+高磷组细胞钙含量明显增加,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。5酸性及碱性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs碱性磷酸酶(ALP)活性的影响:与正常对照组比较,p H7.4+高磷组及p H7.7+高磷组细胞ALP水平均有不同程度升高(P0.05);与p H7.4+高磷组比较,p H7.1+高磷组细胞ALP水平降低,p H7.7+高磷组细胞ALP水平明显升高,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。6酸性及碱性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs中Runx2表达的影响:RT-PCR法检测各组细胞Runx2m RNA表达情况显示,与正常对照组比较,p H7.4+高磷组及p H7.7+高磷组细胞Runx2m RNA表达均有不同程度的增加(P0.05);与p H7.4+高磷组比较,p H7.1+高磷组细胞Runx2m RNA表达减少,p H7.7+高磷组细胞Runx2m RNA表达明显增加,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。Western-blot方法检测各组细胞Runx2蛋白表达情况显示,与正常对照组比较,p H7.4+高磷组及p H7.7+高磷组细胞Runx2蛋白表达均增加(P0.05);与p H7.4+高磷组比较,p H7.1+高磷组细胞Runx2蛋白表达减少,p H7.7+高磷组细胞Runx2蛋白表达明显增加,各组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:酸性环境可以抑制慢性肾衰竭大鼠血管钙化的发生,碱性环境可以促进慢性肾衰竭大鼠血管钙化的发生,其机制可能是通过调节Runx2的表达,进而影响了血管平滑肌细胞成骨/成软骨样表型转化来实现的。
【关键词】：慢性肾衰竭 血管钙化 酸性环境 碱性环境 β-甘油磷酸 血管平滑肌细胞 钙含量
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692.5
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-16
• 材料与方法16-27
• 结果27-29
• 附图29-31
• 附表31-32
• 讨论32-35
• 结论35-36
• 参考文献36-39
• 综述 BMP-2 与慢性肾脏病患者血管钙化关系的探讨39-48
• 参考文献44-48
• 致谢48-49
• 个人简历49

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本文编号：962640