靶向Ax1抗体的制备与鉴定

发布时间：2017-10-09 02:34

  本文关键词：靶向Ax1抗体的制备与鉴定

  更多相关文章： Axl anti-Axl抗体 肿瘤迁移

【摘要】：目的:受体酪氨酸激酶作为细胞跨膜蛋白,在恶性肿瘤细胞的信号转导中发挥重要的作用,参与调节细胞生长、分化、粘附、增殖和迁移等多个生理过程。因此受体酪氨酸激酶是癌症治疗和药物研发的热门分子靶点。Axl是受体酪氨酸激酶TAM家族成员之一,Axl及其配体Gas6在许多恶性肿瘤中都有高表达。近年来,Axl/Gas6作为癌症治疗的新靶点引起了广泛关注。单克隆抗体药物以其特异性强、安全性高、毒性低、临床疗效好等优点,在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。针对Axl靶点开发特异性候选抗体药物,将为肿瘤临床治疗提供更多选择。方法:本研究通过杂交瘤技术制备靶向Axl功能性单克隆抗体。借助生物信息学、结构生物学对Axl胞外段进行序列、结构分析,将Axl参与与Gas6相互作用的功能域基因克隆到pGEX-4T-1表达载体中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21中,以IPTG诱导、表达并纯化获得目标蛋白。利用目标蛋白免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、杂交瘤细胞克隆化培养,利用ELISA、流式细胞术、Western印迹等实验进行抗体筛选;钓取目标抗体基因,进行基因序列比对分析;进一步通过竞争ELISA、抑制增殖、划痕实验、迁移实验等实验评价抗体体外生物学活性。结果:1、抗原的制备对人Axl胞外段进行序列、结构分析,结果提示Axl胞外区的Ig-like-C2-type-1(27-128aa)为Gas6识别的功能域。将包含Axl全长中第27-128aa(F1)的基因克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-F1表达质粒并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,优化后获得GST-F1可溶性表达并亲和纯化;经SDS-PAGE电泳和Western印迹等实验方法鉴定,表达纯化获得的蛋白为预期的GST-F1融合蛋白,为免疫动物制备单克隆抗体奠定了基础。2、抗Axl mAb的制备、筛选和鉴定GST-F1融合蛋白免疫BALB/c小鼠后进行杂交瘤融合,以GST-F1融合蛋白进行elisa筛选,同时以gst蛋白进行负性筛选,挑取特异性识别gst-f1而不与gst蛋白结合的抗体克隆。进一步结合流式细胞筛选,最终获得2株稳定分泌抗axlmab的杂交瘤细胞株(8-11,16-7)。扩大培养杂交瘤细胞8-11、16-7,制备小鼠腹水,经纯化获得抗体。利用小鼠单克隆抗体亚型检测试剂盒分析,显示2株抗体株抗体的重链亚类为igg3,轻链为κ型。elisa结果显示,筛选得到的2株抗axlmabs不仅可以特异性识别gst-f1抗原,同时可以特异性识别真核表达的axl胞外段与人igg-fc融合蛋白(fc-axl-ecd);利用axl高表达的细胞株进行westernblot以及流式细胞分析,结果显示筛选得到的2株抗axlmabs可以特异性识别天然表达的axl蛋白。钓取了2株抗体的基因并测得基因序列,所得序列在genbank中与抗体核酸序列进行比对分析,结果显示2株抗体的轻链和重链的可变区序列与提交的小鼠igg可变区序列的同源性均超过96%,确定基因序列为抗体序列;分析抗体轻链和重链可变区基因,确定抗体的fr区和cdr区。3、抗axl单克隆抗体体外生物学活性竞争elisa、抑制增殖、划痕实验、迁移实验等实验结果显示,获得的两株抗axl单克隆抗体具有良好的体外生物学活性。竞争elisa的结果显示,抗axlmab能特异性竞争gas6结合axl蛋白。借助axl高表达的mda-mb-231细胞进行抗体生物学活性评价,结果显示抗axlmab使内源性的axl含量减少,并同时抑制其磷酸化,抑制增殖实验结果显示,筛选获得的抗axlmab对mda-mb-231细胞的增殖无明显影响;transwell实验和划痕实验结果显示,抗axlmab抗体能显著抑制mda-mb-231细胞迁移能力。结论:1、通过计算机模拟分析,确定人axl与gas6相互作用的关键结构域,并经原核表达、纯化,获得了纯度较高的gst-f1的融合蛋白片段。2、通过杂交瘤技术获得了2株特异性识别人axl的单克隆抗体8-11,16-7。3、抗axlmab在一定程度上可以特异性阻断gas6与axl结合,下调axl表达,抑制axl磷酸化;抗axlmab抗体对mda-mb-231细胞迁移能力有抑制作用,但是对其抑制增殖无明显影响。
【关键词】：Axl anti-Axl抗体 肿瘤迁移
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R692
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-12
• 前言12-16
• 材料与方法16-25
• 结果25-30
• 附图30-44
• 讨论44-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 综述 靶向Axl药物在癌症治疗中的研究进展52-62
• 参考文献58-62
• 致谢62-63
• 个人简历63

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本文编号：997709