浒苔多糖对脓毒症脑病大鼠的脑保护作用及其机制研究

发布时间：2018-03-17 15:01

本文选题：脓毒症相关性脑病　切入点：浒苔多糖　出处：《青岛大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脓毒症相关性脑病(Sepsis-associated encephalopathy,SAE)是脓毒症患者常见的弥漫性脑功能障碍,与脓毒症患者的死亡率密切相关。SAE引起的认知功能障碍是主要的神经损伤之一,与症状的严重程度并无相关性,但对患者远期的生活质量影响较大。因此,迫切需要探索SAE的发病机制,并开发相应的药物以减轻SAE的严重程度,最终降低SAE的死亡率。氧化应激与SAE的发病密切相关。过多的氧自由基和/或抗氧化剂缺乏对大脑的不同区域造成明显的形态和认知功能障碍,而通过药物抑制氧化应激确实可以逆转脓毒症相关性脑病大鼠出现的认知能力下降。此外,高水平的诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)也可以促进SAE的发生。脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经营养因子家族中的一员,广泛分布在大脑中。BDNF在神经元存活和突触传递中发挥重要作用。在SAE大鼠模型中,丙戊酸通过激活BDNF可以显著改善SAE大鼠认知功能障碍,提示BDNF可以作为缓解SAE的有用治疗靶标。浒苔多糖(Enteromorpha clathrate polysaccharides,ECP)是从浒苔中纯化的多糖成分,具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用。浒苔多糖可显著降低脓毒症大鼠中白细胞和中性粒细胞的数量,从而减轻炎症反应;提高淋巴细胞数和CD 4+T淋巴细胞数,从而改善免疫功能。然而,浒苔多糖是否能够改善脓毒症大鼠的认知表现仍然难以捉摸。因此,本研究旨在探讨浒苔多糖对SAE的脑保护作用,并找出潜在的机制。目的:本研究旨在观察浒苔多糖腹腔注射对脓毒症大鼠认知功能的影响,并探索其脑保护作用的机制,为临床的应用提供一定理论依据。方法:(1)分组及建立模型将SD大鼠随机分为对照组(CON组)、SAE组、SAE+浒苔多糖组(SAE+ECP组),每组20只,SAE+浒苔多糖组腹腔内注射100 mg/kg浒苔多糖,CON组和SAE组于相同时间点腹腔内注射生理盐水。选用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立SAE模型。取SD大鼠,用2%戊巴比妥钠(0.3m L/100 g)腹腔注射麻醉,腹部剃毛并用碘伏消毒,沿腹中线剪开2 cm腹部切口,暴露盲肠,在回盲瓣远端结扎盲肠,然后用针刺穿刺盲肠2次,轻轻挤压盲肠,使少量的肠内容物渗出,然后将盲肠返回到腹腔,关闭腹腔。假手术组大鼠行剖腹,并将盲肠外置1分钟,不予盲肠穿刺或结扎,然后将盲肠放回腹腔并关腹。每只手术操作的大鼠术后每6小时给予皮下注射生理盐水(30 m L/kg)及头孢曲松(30mg/kg)。制作脓毒症大鼠模型24小时后评估大鼠神经行为学,计算神经反射评分≤6分的为SAE模型。不符合SAE模型标准的,则放弃该例大鼠并重新制作大鼠脓毒症模型补充。(2)大鼠一般状况观察各组大鼠的精神状况,有无立毛、寒战、腹泻和出血倾向,测量术前、术后6 h、12 h和24 h大鼠的体温、心率和平均动脉压等基本生命体征,并测量实验大鼠7 d的体重变化。(3)行为学实验采用旷场实验、Morris水迷宫实验及Y-迷宫测试评估各组大鼠的一般活动能力和学习记忆能力。(4)氧化应激反应指标采用硝酸还原酶法测定各组大鼠海马NO含量;采用L-精氨酸氧化法测定各组大鼠海马i NOS含量;采用硫代巴比妥酸法测定各组大鼠海马丙二醛(MDA)活性;采用黄嘌呤氧化酶法测定各组大鼠海马超氧化物歧化酶(SOD)活性;此外,还检测了大鼠海马组织过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。(5)BDNF/p-Trk B的表达处死大鼠,取大鼠海马组织,用Western blot法分别检测BDNF和p-Trk B的表达。结果:(1)动物一般状况对照组大鼠一般状况良好,心率、呼吸频率和体温等基本生命体征平稳;SAE组大鼠表现出蜷缩少动、竖毛,个别大鼠出现偏瘫、癫痫发作;而且平均动脉压和体重明显下降,心率显著升高。(2)行为学试验旷场实验显示,各组大鼠的探索路程差异无统计学意义(P0.05),说明假手术、SAE或ECP不影响大鼠的自主活动。在Morris水迷宫实验中,CON组和SAE+ECP组大鼠到达目标平台的时间明显少于SAE组,差异具有统计学意义(P0.01);SAE组大鼠的游泳距离较CON组和SAE+ECP组存在显著差异(P0.01),但游泳速度无统计学差异(P0.05);CON组和SAE+ECP组大鼠跨越平台次数、原平台所在象限游泳时间比例均明显高于SAE组,组间差异具有统计学意义(P0.01)。在Y-迷宫测试中,与CON组和SAE+ECP组相比,SAE组大鼠达标所需的训练次数较多,差异均有统计学意义(P0.01)。这些结果均提示SAE导致明显的学习记忆损害,而浒苔多糖治疗能明显改善SAE大鼠的学习记忆功能。(3)各组大鼠海马氧化应激指标各组大鼠的血氨浓度之间无统计学差异(P0.05),说明浒苔多糖在此实验中没有引起血清氨浓度改变从而影响认知功能;NO含量变化:与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组NO含量显著升高;与SAE组相比较,SAE+ECP组NO含量显著降低(P0.01);i NOS活性变化:与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组i NOS活力显著升高(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组i NOS活性显著降低(P0.01);MDA含量变化:与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组MDA含量显著升高(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组MDA含量显著降低(P0.01);CAT活性变化:与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组CAT活性显著降低(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组CAT活性显著升高(P0.01);SOD活性变化:与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组SOD活性显著降低(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组SOD活性显著升高(P0.01);GSH-Px活性变化:与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组GSH-Px活性显著降低(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组GSH-Px活性显著升高(P0.01);这些结果均表明,SAE组大鼠海马区存在明显的氧化应激损伤,浒苔多糖治疗后这些损伤可得到明显改善。(4)各组大鼠海马组织中BDNF和p-Trk B表达水平与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组BDNF表达水平显著降低(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组BDNF表达水平显著升高(P0.01);与CON组相比,SAE组和SAE+ECP组p-Trk B表达水平显著降低(P0.01);与SAE组相比较,SAE+ECP组p-Trk B表达水平显著升高(P0.01);结果表明,SAE引起大鼠海马组织中BDNF和p-Trk B蛋白表达下调,浒苔多糖处理可促进BDNF和p-Trk B的表达。结论:(1)CLP组大鼠完全模拟了脓毒症典型临床表现,应用神经行为学检查提示大鼠脓毒症相关性脑病(SAE)模型制作成功,为后续SAE机制研究做好基础。浒苔多糖能保护SAE大鼠认知记忆功能。(2)脓毒症可引起大鼠海马组织氧化应激损伤,而浒苔多糖的使用可显著降低氧化应激的水平,表明浒苔多糖可能通过抑制氧化应激反应发挥其功效。(3)脓毒症相关性脑病可导致SAE大鼠海马组织中BDNF的表达和Trk B磷酸化水平降低,而预先给予浒苔多糖可以促进BDNF的表达和Trk B磷酸化水平,表明浒苔多糖可能通过BDNF-Trk B信号通路发挥其功效。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.7;R747.9

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