VEGF-A 165对稳转TDP-25质粒的NSC34细胞的ALS细胞模型的影响及作用机制研究

发布时间：2017-03-28 17:14

  本文关键词：VEGF-A 165对稳转TDP-25质粒的NSC34细胞的ALS细胞模型的影响及作用机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是中枢神经系统运动神经元的退行性病变,主要表现为肌无力、肌萎缩、瘫痪。发病年龄一般在35-50岁之间,生存期3-5年,迄今尚无有效的治疗方法,目前利鲁唑是市场上唯一被美国FDA批准对ALS治疗有效的药物,但只能平均延长患者生存期2-3月。大约90-95%为散发型,5-10%为家族型。在家族型ALS中,突变的超氧化物歧化酶-1(SOD-1)基因是发病的主要原因。另外,编码突变蛋白TDP-43的TARDBP基因以及编码突变型RNA结合蛋白的FUS基因,都是与家族型ALS发病相关的基因。TDP43是由TARDBP基因中的6个外显子编码,TDP-43蛋白由414个氨基酸组成,由2个RNA识别序列和1个富含甘氨酸的C末端组成,具有DNA以及RNA结合蛋白的能力。同时,TDP-43可在富含甘氨酸的末端被截断,形成两个C末端的片段,分别为25KD、35KD,TDP25、TDP35都具有细胞毒性,其中TDP25的细胞毒性是其中最强的。虽然ALS的发病机制并不十分明确,但是研究表明与线粒体的损伤、谷氨酸兴奋性毒性、免疫系统的破坏、异常蛋白聚集等有关。此外,神经营养的供应不足也是重要原因。各种生长因子包括VEGF、IGF-1等在ALS中的表达是不同的,但它们都有巨大的神经保护作用,促进ALS中运动神经元的增殖。VEGF是血管源性的生长因子,它对各种细胞都有高效的促进分裂能力以及保护神经细胞避免脑损害的能力,对血管内皮细胞的生长和调控有着重要的作用,而且对神经生长、神经元的迁移有着直接的作用。最近的研究表明,当神经细胞处于低氧、低糖、氧化应激等不利条件时,VEGF可作为调节者调控各种复杂的机制,避免神经元死亡和刺激神经生长。VEGF家族可分为7种亚型,包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PLGF、VEGF-E、sv VEGF。VEGF-A是由33-42k Da组成的二聚体糖蛋白。它的基因的表达受许多条件的影响,包括低氧、生长因子、NO、p53突变、甲状腺生长激素、肿瘤生长因子。VEGF-A的高表达信使RNA主要存在于肾上腺、肝脏、心脏、脑。VEGF-A由8个外显子和7个内含子组成,根据其活性的不同又分为多种亚型,其中VEGF165是活性最强的。研究表明,在过表达VEGF-A的SOD-1 G93A转基因ALS小鼠与单纯的SOD-1 G93A转基因ALS小鼠相比,其神经元的死亡减少、疾病的发病时间延迟、生存率增加。目前尚无VEGF-A 165在稳转TDP25的NSC34细胞的ALS细胞模型中治疗效果的研究报道。目的:研究VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞的ALS细胞模型的保护作用,并进一步探讨VEGF-A 165发挥保护作用的机制。方法:首先采用流式细胞仪筛选出稳转TDP25的NSC34细胞,将稳转TDP-25质粒的NSC34细胞复苏、传代、培养,提取蛋白质,进而通过免疫印迹法检测细胞中TDP25蛋白的表达水平,证明选用的细胞是稳转TDP25的NSC34细胞以建立ALS的细胞模型。然后用不同浓度的VEGF-A 165处理稳转TDP25的NSC34细胞,采用CCK8试剂盒检测细胞活力,确定VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞的最适药物浓度。用最适药物浓度的VEGF-A 165干预细胞,测定乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量观察VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞的保护作用。最后,采用免疫印迹法检测在凋亡通路上caspase3蛋白水平的变化,及在氧化应激通路上HO-1蛋白水平的变化,以研究VEGF-A 165的作用通路。结果:1通过western blot法检测流式细胞仪筛选后细胞中TDP25蛋白,结果显示细胞中有TDP25蛋白的表达,表明选用的细胞是稳转TDP25的NSC34细胞,成功建立ALS的细胞模型。2观察不同浓度的VEGF-A 165处理稳转TDP25的NSC34细胞后细胞的生长情况及细胞形态,CCK8试剂盒检测细胞活力,结果发现,当VEGF-A 165浓度达到5ng/ml时,细胞数目多,细胞突起展开,细胞形态最好,细胞活力最高,因此筛选出VEGF-A 165的最适药物浓度为5ng/ml。3用最适药物浓度的VEGF-A 165干预细胞,LDH、MDA的检测结果显示,给药组与对照组比较给药组LDH水平、MDA水平均明显下降(P0.05)。4 western blot法检测caspase3、HO-1蛋白水平的变化,结果显示给药组与对照组比较,caspase3和HO-1蛋白水平均显著降低(P0.01)。结论:VEGF-A 165对稳转TDP25的NSC34细胞有保护作用,其发挥保护作用是通过抑制caspase3、HO-1水平实现的。
【关键词】：VEGF 肌萎缩侧索硬化 NSC34细胞 TDP43 凋亡
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 英文缩写10-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-24
• 结果24-25
• 附图25-30
• 讨论30-32
• 结论32
• 参考文献32-36
• 综述 凋亡在神经变性病中的作用36-46
• 参考文献41-46
• 致谢46-47
• 个人简历47

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