RFK-新的内源性抗缺血性脑损伤蛋白的作用及机制研究

发布时间：2022-11-11 18:00

　　目的:本研究通过观察内源性基因RFK表达上调和表达下调的两种形式,对RFK与缺血性脑损伤的关系进行了研究,并对其抑制神经元缺血时的内质网应激通路机制和通过外源性补充核黄素对RFK基因功能低下的补偿作用进行了研究。第一部分构建RFK慢病毒载体方法:（1）以鼠RFK原始c DNA为模板,进行PCR扩增。用p Lenti6.3-IRES2-EGFP/V5DEST系列质粒载体构建包含RFK的过表达载体,同时以Lenti-EGFP质粒载体构建成空病毒载体。（2）首先构建真核载体pc DNA,选择3个靶点设计3组si RNA干扰序列,连接转化鉴定。将制备好的3组si RNA干扰序列载体转染C6细胞,提取总RNA及总蛋白。应用q PCR和Western Blotting技术对si RNA干扰前后C6细胞的RFK表达进行分析,筛选最佳针对RFK基因的si RNA干扰序列。然后以最佳干扰序列的质粒载体为模板扩增并构建到p Lenti6.3-MCS/V5 DEST系列质粒载体,构建成干扰RFK表达慢病毒载体。将所得RFK过表达慢病毒载体、空病毒载体和干扰RFK表达慢病毒载体感染293T细胞,检测病毒滴度。... 

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
中文摘要
abstract
引言
文献综述
第一部分 构建RFK慢病毒载体
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验试剂
        1.3 实验器材
        1.4 主要试剂配置
    2 实验方法
        2.1 RFK基因慢病毒载体制备
        2.2 原代神经元培养
        2.3 RFK慢病毒载体转染
        2.4 大鼠MCAO手术
        2.5 Western blotting
        2.6 统计学方法
    3 实验结果
        3.1 RFK基因过表达慢病毒载体制备
        3.2 干扰RFK基因表达慢病毒载体制备
        3.3 滴度计算
    4 讨论
第二部分 RFK抗缺血性脑损伤的作用机制
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 实验试剂
        1.3 实验器材
        1.4 主要试剂配置
    2 实验方法
        2.1 脑水肿测定
        2.2 RFK表达上调对脑梗死面积的影响
        2.3 制备OGD模型
        2.4 细胞形态学观察
        2.5 神经元细胞活力检测
        2.6 流式细胞仪检测凋亡
        2.7 增加摄入核黄素对RFK基因功能低下的补偿作用
        2.8 其它操作方法
        2.9 统计学方法
    3 结果
        3.1 核黄素抑制MCAO后大鼠脑水肿
        3.2 RFK表达上调抑制MCAO后大鼠脑梗死面积
        3.3 RFK表达上调与下调对细胞形态学的影响
        3.4 RFK表达上调及下调对OGD诱导的神经元细胞活力的影响
        3.5 RFK表达上调及下调对OGD诱导的神经元细胞凋亡的影响
        3.6 RFK 表达上调及下调对内激网应激相关蛋白的影响
        3.7 加入 Erodoxin,RFK 表达上调对神经元细胞活力的影响
        3.8 增加摄入核黄素对RFK基因功能低下的补偿作用
        3.9 去除核黄素对 RFK 表达上调及下调的神经元细胞活力与细胞凋亡的影响
        3.10 补充核黄素、FMN,FAD,RFK 表达下调神经元细胞活性、凋亡结果
    4 讨论
全文结论
参考文献
附录
学位论文答辩委员会名单
个人简介



本文编号：3705490