基于蛋白质组学方法探索PINK1蛋白下游底物

发布时间：2022-12-09 23:57

　　PINK1（PTEN Induced Putative Kinase 1）是定位于线粒体的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,PD（Parkinson’s disease）病人的PINK1基因突变大多导致其激酶活性下降或缺失,因此研究认为PINK1的激酶活性对维持多巴胺能神经元的稳态是不可或缺的。线粒体去极化背景下PINK1通过磷酸化下游底物诱导自噬/线粒体自噬。除了自噬途径外PINK1在PD发病过程中的其他作用机制或者是联合机制以及具体机制如何发挥作用目前还值得进一步研究。本实验通过基因敲除技术获得PINK1基因敲除小鼠。取PINK1野生型和缺失型的新生小鼠做原代神经元培养,用线粒体去极化药物CCCP分多个时间点（15 min和45 min,2 h和6h）处理做PD模型。然后大规模检测野生型和缺失型小鼠神经元细胞中蛋白质及其磷酸化水平变化情况,获取蛋白质组学和磷酸组学数据后,分析发现多种激酶信号发生改变。我们挑选了一些潜在的靶点展开研究。发现DAPK1与PINK1存在部分共定位且其Ser289和Ser333位点可能依赖于PINK1激酶活性的变化;ULK1的Ser757位点和Ser555位点可能依... 

【文章页数】：89 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
附件
内容摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 帕金森氏病
        1.1.1 PD致病基因PINK1 的功能
    1.2 质谱实验方法概述
        1.2.1 DDA(数据依赖性采集)数据采集分析技术
        1.2.2 DIA(非数据依赖性采集)数据采集模式
    1.3 ULK1 与自噬
        1.3.1 ULK1 与自噬
    1.4 DAPK1 与细胞自噬和凋亡
        1.4.1 DAPK1 分子信息
        1.4.2 DAPK1 与自噬和凋亡
    1.5 前期研究进展
        1.5.1 蛋白质组学和磷酸化组学结果显示PINK1 参与多条细胞信号通路
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验药品与试剂
        2.1.2 实验仪器
        2.1.3 常用细胞
        2.1.4 耗材
        2.1.5 基因克隆引物
        2.1.6 质粒
        2.1.7 抗体
        2.1.8 实验试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 分子克隆
        2.2.2 细胞水平实验方法
        2.2.3 仪器参数设置
第三章 实验结果与分析
    3.1 小鼠基因型鉴定及CCCP诱导模型验证
    3.2 磷酸化变化蛋白功能分析
    3.3 磷酸化水平仅在PINK1-WT中上调的蛋白
    3.4 小规模验证磷酸化水平上调的蛋白是否是PINK1 直接底物
    3.5 PINK1与ULK1 以及DAPK1 的相互作用
    3.6 CCCP处理细胞PINK1 激活后潜在底物磷酸化水平变化情况
        3.6.1 ULK1 磷酸化水平变化与PINK1 有关联
        3.6.2 AMPK磷酸化水平变化随CCCP处理变化但与PINK1 无关
        3.6.3 ERK磷酸化水平变化随CCCP处理变化但与PINK1 无关
    3.7 DAPK1 的磷酸化变化情况影响细胞自噬和凋亡
第四章 总结与讨论
参考文献
科研成果
致谢



本文编号：3715629