淀粉样蛋白致病机理及其调控的体外研究

发布时间：2023-01-30 11:30

　　淀粉样蛋白的错误折叠和异常聚集是2型糖尿病、阿兹海默病、海绵状脑病等淀粉样变性病的重要致病原因之一。淀粉样蛋白的细胞毒性主要来源于淀粉样蛋白的聚集、氧化压力的产生以及与细胞膜的相互作用；细胞毒性的产生过程会受到翻译后修饰、金属离子、共存蛋白以及二维细胞膜表面等多种因素的调控。在本论文中，我们重点研究了磷酸化和泛素化等翻译后修饰、金属铜离子、二维负电表面等因素对淀粉样蛋白细胞毒性产生的调控机理，并同时着重对蛋白定点泛素化合成的新方法进行了探索。本研究对理解淀粉样变性病病理机理具有重要意义，且为相应的治疗手段和药物的开发提供了理论基础。 我们首先利用高效原子力显微镜和石英微天平技术，对胰岛淀粉样多肽（hIAPP）和胰岛素（Insulin）在五氧化二钽表面以不同比例共聚集的过程和形貌特征进行了研究，结果表明不同比率的hIAPP/Insulin在负电表面形成不同的聚集纳米结构，表现为成熟纤维-寡聚体纤维-寡聚体-前体原纤维-环状纤维等形式。石英晶体微天平表征结果显示蛋白共混后对表面的吸附作用更强。研究结果对进一步研究2型糖尿病的病理机理有重要的参考价值。 我们利用多肽固相合成方... 

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
目录
第1章 引言
    1.1 淀粉样蛋白及其介导的淀粉样相关疾病
        1.1.1 胰岛淀粉样多肽与 2 型糖尿病
        1.1.2 Tau 蛋白与阿兹海默病
        1.1.3 阮病毒蛋白与海绵状脑病
        1.1.4 淀粉样蛋白的主要细胞毒性来源
            1.1.4.1 淀粉样蛋白与聚集
            1.1.4.2 淀粉样蛋白与氧化压力
            1.1.4.3 淀粉样蛋白与细胞膜的作用
    1.2 金属铜离子对淀粉样相关蛋白致病机理的调控
        1.2.1 活性氧的产生与氧化压力
        1.2.2 金属铜离子与 Tau 蛋白及重复片段的相互作用
        1.2.3 金属铜离子介导 Tau 蛋白及其重复片段产生氧化压力
    1.3 翻译后修饰对淀粉样相关蛋白致病机理的调控
        1.3.1 磷酸化在 Tau 蛋白介导阿兹海默病过程中的作用
        1.3.2 淀粉样相关蛋白的泛素化修饰
        1.3.3 定点泛素化修饰蛋白的体外合成方法学研究进展
    1.4 问题的提出和本论文主要研究的内容
第2章 胰岛淀粉样多肽与胰岛素在氧化钽表面共聚集性质的研究
    2.1 本章引论
        2.1.1 淀粉样蛋白与二维界面相互作用的研究进展
        2.1.2 胰岛淀粉样多肽与胰岛素相互作用的研究进展
        2.1.3 淀粉样蛋白聚集体的不同组装形式
        2.1.4 本课题的提出
    2.2 实验原理与方法
        2.2.1 高效液相原子力显微镜技术
        2.2.2 石英晶体微天平技术
        2.2.3 本课题所用试剂和仪器
        2.2.4 样品制备与实验操作
    2.3 实验结果与讨论
        2.3.1 模拟生物膜表面的五氧化二钽二维界面模型的构建
        2.3.2 模拟生理环境研究表面聚集过程模型的构建
        2.3.3 不同配比 hIAPP/Insulin 在五氧化二钽表面聚集形貌的表征
        2.3.4 hIAPP 在五氧化二钽表面聚集形貌的表征
        2.3.5 不同比例 Insulin 与 hIAPP 共混对聚集形貌的影响
        2.3.6 Insulin 在五氧化二钽二维表面聚集形貌及结构的表征
        2.3.7 hIAPP 与 Insulin 在五氧化二钽表面共聚吸附动力学表征
    2.4 本章小结
第3章 磷酸化对铜离子介导 Tau 蛋白 R3 片段产生氧化压力的影响
    3.1 本章引论
    3.2 实验原理与方法
        3.2.1 利用 Fmoc 策略进行多肽固相合成方法
        3.2.2 高效液相色谱用于多肽的分离
        3.2.3 BC（浴铜灵）法检测一价铜离子含量
        3.2.4 Ellman 实验用于自由巯基检测
        3.2.5 3-CCA（香豆素-3-羧酸）用于检测羟基自由基
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 R3 与 pR3 多肽的合成与纯化
        3.3.2 R3，pR3 肽段能够还原铜
        3.3.3 R3，pR3 肽段能够被二价铜离子催化氧化
        3.3.4 磷酸化可以加速 Cu2+介导 R3 羟基自由基的产生
        3.3.5 磷酸化的影响依赖于 pH 环境条件
    3.4 本章小结
第4章 定点泛素化修饰蛋白体外合成方法学的研究
    4.1 本章引论
    4.2 实验原理与方法
        4.2.1 MALDI-TOF 质谱用于蛋白分子量的检测及样品的制备
        4.4.2 Intein 技术用于 C 端硫酯蛋白的获得
        4.2.3 泛素相关蛋白表达的常用操作方法
        4.2.4 几丁质亲核柱用于蛋白纯化实验方法
        4.2.5 SDS-PAGE 用于蛋白质分子量检测及操作方法
        4.2.6 常用试剂和溶液的配制
    4.3 实验结果与讨论
        4.3.1 C-末端修饰为硫脂的泛素单体的合成
        4.3.2 C-末端含乙烯基和巯基活性官能团修饰的泛素单体的合成
        4.3.3 Ub-AA 与含巯基小分子的光照偶联
        4.3.4 利用 Ub-SH 与含巯基小肽 prp175-195进行二硫键偶联
        4.3.5 含叠氮基非天然氨基酸单体的合成
        4.3.6 K63stop 泛素质粒的构建
        4.3.7 63 位引入非天然氨基酸的泛素蛋白硫酯的合成
    4.4 本章小结
结论
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果


【参考文献】：
博士论文
[1]淀粉样蛋白聚集的机理研究和抑制剂的设计、合成与评价[D]. 陈媚莎.清华大学 2012
[2]阿尔茨海默病相关多肽与Cu～（2+）结合性质的研究[D]. 马庆丰.清华大学 2006

硕士论文
[1]阿尔兹海默病相关蛋白Aβ不同聚集体与铜离子的作用[D]. 房川琳.清华大学 2010



本文编号：3733026