硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态

发布时间：2017-05-22 16:22

  本文关键词：硫化氢通过AMPK激活调控脑缺血后小胶质细胞的极化状态，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的:硫化氢(H2S)是重要的内源性气体信号分子。本课题组研究表明在LPS导致的中枢神经炎症模型中H2S通过AMPK(腺苷酸活化蛋白激酶)激活选择性诱导小胶质细胞另类(M2)极化。我们还发现H2S供体在动物模型中抑制脑缺血后过度的中枢神经炎症,但分子机制尚不明确。基于前期研究,本课题的目的是探讨硫化氢是否在脑缺血后通过AMPK活化促进小胶质细胞M2极化,进而促进抑制枢神经炎症并脑缺血后血管新生。研究方法:收集神经元缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation,OGD)处理后的细胞培养上清,以此条件上清处理BV2小胶质细胞和原代小胶质细胞模拟体内脑缺血激活小胶质细胞的体外模型;应用小鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)法建立动物缺血性脑卒中模型。利用缓释H2S供体(ADT-OH)和过表达胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase,CBS)的方法研究H2S选择性诱导小胶质细胞M2极化的机制。应用Western Blot技术检测AMPK活化(磷酸化)、CBS以及胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表达;通过实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)技术检测M1(促炎状态)/M2(抗炎状态)细胞因子的表达变化;应用AMPK和Ca MKKβ抑制剂以及si RNA技术探索H2S促进小胶质细胞M2极化是否依赖于AMPK及Ca MKKβ;利用脑微血管内皮细胞(b End3)在基质胶上形成血管状结构的能力探讨在条件上清处理时ADT-OH是否通过小胶质细胞M2极化促进血管新生。在动物水平上,通过小鼠MCAO模型验证H2S供体对AMPK活化和M1/M2细胞代表因子的表达的影响。结果:在神经元缺氧缺糖条件上清处理BV2小胶质细胞或原代小胶质细胞建立的脑缺血激活小胶质细胞的细胞模型中,Western Blot结果显示:与溶剂对照组(Con)和正常神经元培养基(Neuron Condition medium,Neuron CM)处理的对照组相比,经缺氧缺糖神经元条件上清处理(OGD Neuron Condition Medium,OGD Neuron CM)的小胶质细胞AMPK活化水平明显降低(P0.05),而ADT-OH在OGD Neuron CM处理时显著提高小胶质细胞AMPK活化水平(P0.05)。Q-PCR/ELISA结果显示:OGD Neuron CM导致小胶质细胞M1极化代表因子(i NOS,IL-1β,IL-6,TNF-α)表达明显升高(P0.05);ADT-OH则下调OGD Neuron CM诱导的M1极化代表因子的表达、并显著上调OGD Neuron CM抑制的M2极化代表因子(ARG,YM1/2,IL-10)的表达(P0.05)。这些结果表明,OGD Neuron CM导致小胶质细胞M1极化,ADT-OH在OGD Neuron CM处理时促进小胶质细胞向M2状态转化。利用神经元条件上清刺激BV2小胶质细胞后检测CBS和CSE的表达,Western Blot和Q-PCR结果均显示:与溶剂对照组(Con)和正常神经元培养基(Neuron Condition medium,Neuron CM)处理的对照组相比,经缺氧缺糖神经元条件上清处理(OGD Neuron Condition Medium,OGD Neuron CM)的BV2小胶质细胞CBS表达水平明显降低(P0.05),CSE表达水平没有明显变化。在BV2小胶质细胞中过表达CBS或转染Vector(对照),无论是否存在OGD Neuron CM刺激,与转染Vector组的BV2细胞相比,过表达CBS的BV2细胞组AMPK活化水平均显著升高,同时CBS过表达组在OGD Neuron CM处理时明显促进BV2细胞向M2活化状态转化(P0.05)。此外,AMPK抑制剂和AMPK si RNA以及Ca MKKβ抑制剂均抑制ADT-OH对BV2细胞向M2状态转化的促进作用(P0.05)。以上实验结果说明,ADT-OH通过促进AMPK活化而促使BV2细胞向M2状态转化。应用脑微血管内皮细胞(b End3)研究ADT-OH通过小胶质细胞M2极化对促进血管新生的作用。OGD Neuron CM和ADT-OH同时处理BV2小胶质细胞24h后获得的条件培养液(OGD Neuron CM+ADT-OH)促进b End3细胞在基质胶上形成血管状结构,而OGD Neuron CM或Neuron CM处理BV2细胞后获得的条件培养液、以及正常BV2细胞培养液均不能促进b End3细胞在基质胶上形成血管状结构。利用BV2细胞转染AMPK si RNA或NC si RNA(对照)研究AMPK对血管新生的影响,结果显示:与NC si RNA(对照)相比,OGD Neuron CM和ADT-OH共处理转染si AMPK的BV2细胞后获得的条件培养液(OGD Neuron CM+ADT-OH+si AMPK)不能促进b End3细胞形成血管状结构。这些结果表明:经神经元条件上清处理后ADT-OH通过AMPK介导的小胶质细胞M2极化机制促进血管的新生。在小鼠脑缺血模型中,ADT-OH能够促进皮层组织中AMPK的活化(P0.05),抑制M1细胞代表因子的表达并且上调M2细胞代表因子的表达(P0.05)。在动物水平上表明了H2S可能通过活化AMK抑制缺血性神经炎症。结论与创新:我们首次表明H2S通过AMPK介导的小胶质细胞M2极化机制在脑缺血后调控中枢炎症应答并促进血管新生。
【关键词】：脑缺血 硫化氢 缺氧缺糖模型 小胶质细胞 5-对羟基苯基-1 2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(ADT-OH)
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 引言10-12
• 实验材料12-19
• 1.1 细胞12
• 1.2 动物12
• 1.3 药品及试剂12-13
• 1.4 抗体及仪器13-14
• 1.5 试剂制备14-19
• 实验方法19-29
• 2.1 BV2 小胶质细胞系培养19
• 2.2 原代小胶质细胞培养19-20
• 2.3 原代神经元的培养20-21
• 2.4 体外神经元缺氧、缺糖（OXYGEN-GLUCOSE DEPRIVATION,OGD）模型的建立21
• 2.5 MTT法检测BV2 小胶质细胞和原代小胶质细胞存活率21
• 2.6 CBS质粒转染过表达实验21-22
• 2.7 CBS/VECTOR质粒转染：22-23
• 2.8 SIRNA干扰敲除AMPK基因（按试剂盒说明书操作）23
• 2.9 脑微血管内皮细胞（BEND3）系和体外血管新生23
• 2.10 WESTERN BLOT23-24
• 2.11 实时荧光定量PCR（REAL-TIME QUANTITATIVE PCR, Q-PCR）24-27
• 2.12 酶联免疫吸附实验（ELISA）：IL-10 含量检测（按照试剂盒说明书操作）27
• 2.13 大脑中动脉阻塞模型（MCAO模型）27-28
• 2.14 统计学方法28-29
• 实验结果29-53
• 讨论53-56
• 结论56-57
• 参考文献57-61
• 综述61-69
• 参考文献65-69
• 英文缩略词表69-70
• 致谢70-71

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