依达拉奉体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

发布时间：2017-05-30 13:06

  本文关键词：依达拉奉体外定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：制备人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUMSCs),检测其表面标志物,研究在不同浓度下依达拉奉(Edaravone)定向诱导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化的可行性及适宜条件,探讨作用机制,为进一步在治疗神经系统疾病方面广泛应用奠定理论基础,为进一步体内相关实验研究提供实验依据。方法：在无菌条件下选取足月健康新生儿脐带10cm,置于H-DMEM/F12培养基中,放置于4℃温箱内保存,移送至细胞培养室,用D-Hank's将标本中的积血完全冲洗干净,剔除脐动脉和脐静脉,将脐带间质组织按照1mm3的大小分割成组织块,用0.2%胶原酶Ⅱ消化,放入含有20%胎牛血清(FBS)、2ng/ml表皮细胞生长因子(EGF)、25mM左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素,100μ g/ml链霉素的DMEM/F12培养液中培养。在倒置显微镜下动态观察其形态学特征变化及增殖情况。当有约90%左右的细胞贴壁生长时,加入胰酶消化细胞、制成细胞悬液,并传代。采用流式细胞术检测消化细胞的细胞表型,包括CD105、CD90、CD73、 CD19、CD34、CD45、CDllb以及组织相容性抗原HLA-DR(MHC-II),用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作为同型对照。P1代细胞是指原代hUMSCs按1：1传代后得到的细胞。在倒置显微镜下动态观察细胞形态学改变,当约90%左右的细胞贴壁生长时即可进行传代,传代分瓶的比例一般为1：2,绘制细胞生长曲线。取正常传代至P4代的hUMSCs,当大约有90%左右的细胞贴壁生长时,通过离心法制成细胞悬液,分别置入六孔板及25 cm2塑料培养瓶中,共分为A、B、C、D四组,前三组作为实验组,最后1组为对照组。A、B、C组分别加入含有依达拉奉(Edaravone)浓度依次为50mg/L、100mg/L、300mg/L的诱导液,每孔含诱导液3m1,每瓶含诱导液5m1,诱导液均用L-DMEM培养基配制,D组只加L-DMEM培养基,继续放置于培养箱中诱导,倒置相差显微镜动态观察细胞形态学改变。分别于诱导的第1、2、4、6、12、18、24小时统计各组细胞变化率,继续培养共24小时,采用免疫细胞化学染色检测各标志物阳性率,各组各时点细胞阳性率,结果以x±s表示,最后选取较适合的诱导浓度。使用Western blot及RT-PCR的方法检测较合适浓度诱导组细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、微管相关蛋白2(MAP-2)蛋白及mRNA水平的情况。结果：原代细胞通过离心法传代培养12h后,大约有60%的细胞逐渐贴壁,细胞形态为菱形、圆点形或者长梭形；随着培养时间延长,贴壁的细胞数量慢慢增加,大部分细胞形态变为长梭形；约90%左右的细胞贴壁生长时,倒置显微镜镜下观察到细胞呈放射螺旋状生长。当细胞融合完全时,按1：2比例继续传代培养,hUCMSCs的增殖能力极其旺盛,传代至P15代细胞均可迅速生长繁殖。通过流式细胞学技术分别检测P3、P5和P10代hUCMSCs,表面分子标志物结果显示各代均表达间充质干细胞标志CD73.CD90和CD105,而不表达造血干细胞标志CDllb、CD19、CD34、CD45和组织相容抗原HLA-DR。加入不同浓度Edaravone后,A组细胞1h后可见零星细胞胞体收缩,折光性增强,细胞形态变为长椭圆形或圆形,伸出一条或多条细长的突起,可视为神经样细胞；4h后神经样细胞约有20%,细胞伸出的突起数量变多,突起的长度及分叉的数量都有所增加,6h后神经样细胞约占总细胞的40%,12h后有约50%的细胞发生以上改变,相邻细胞伸出的突起会逐渐相互交缠连接成网状,24h时神经样细胞所占比例达到顶峰,只有少数细胞没有变为神经样细胞,但可见少量细胞脱落；B组在加入Edaravone 1h后即可看到明显变化,大量细胞胞体收缩,胞体两侧会伸出细长的突起,神经样细胞约占40%,4h时可见约70%的细胞发生这样的变化,12h时神经样细胞所占比例达到顶峰,并逐渐有少量细胞开始脱落；C组细胞1h时即可见大量细胞变为神经样细胞,4h时变化的细胞达到顶峰,直至24h均保持高变化率,脱落的细胞不多。D组为对照组,连续观察24h与添加诱导液前无明显改变。于诱导分化12h时,通过免疫细胞化学方法检测各组细胞的神经标志物。A、B、C三组NSE阳性率依次为54.03±1.76%、80.87±2.03%、90.97±4.06%;Nestin的阳性率为59.64±2.38%、81.70±3.08%、92.98±3.04%：、GFAP的阳性率为53.53±2.93%、78.26±4.17%、88.27±2.36%；MAP-2为阴性,C组细胞(诱导液浓度为300mmg/L)表达各神经细胞标志物阳性率最高且稳定。通过RT-PCR技术检测C组细胞Oh、2h、4h、6h、12h、24h(以空白组为Oh)的各神经细胞标志物及内参GAPDG的表达量,计算相对表达量。GFAP的mRNA相对表达量依次为0、0、0.238±0.014、0.298±0.010、0.504±0.696、0.597±0.054；NSE的mRNA相对表达量依次为0、0.275±0.020、0.499±0.021、0.877±0.022、0.859±0.018、0.438±0.016；空白组即可微量表达Nestin, mRNA的相对表达量随时间的延长依次为0.244±0.009、0.654±0.025、0.794±0.041、0.915±0.049、0.898±0.044、0.408±0.012；诱导前后始终未见表达MAP-2,各组各时间点均可高表达GAPDH.继续通过Westren blot技术检测C组细胞各时间点均神经标志物的表达量,GFAP的蛋白相对表达量依次为0、0、0.203±0.021、0.221±0.023、0.353±0.022、0.746±0.037；NSE的蛋白相对表达量依次0、0.323±0.038、0.403±0.026、0.557±0.021、0.553±0.025、0.214±0.030：Nestin的蛋白相对表达量随时间的延长依次0.385±0.014、0.507±0.017、0.842±0.008、0.861±0.007、0.886±0.018、0.466±0.010；未见表达MAP-2,各组各时间点均可高表达GAPDH.结论：hUMSCs作为一种能够在体外稳定培养、传代的干细胞,P15代以内均可迅速生长繁殖,通过流式细胞技术检分别检测P3、P5和P10代hUCMSCs,表面分子标志物结果显示各代均表达间充质干细胞标志CD73、CD90和CD105,而不表达造血干细胞标志CDllb、CD19、CD34、CD45和组织相容抗原HLA-DR。一定浓度下的Edaravone可以将hUCMSCs定向分化为神经样细胞,300mmg／L是一个较恰当的诱导浓度,经过Edaravone诱导后的细胞可表达NSE、Nestin和GFAP,不表达MAP-2。
【关键词】：依达拉奉 人脐带间充质干细胞 神经样细胞 免疫细胞化学染色 Westren blot 及RT-PCR
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-24
• 结果24-28
• 附图28-41
• 附表41-43
• 讨论43-45
• 结论45
• 参考文献45-48
• 综述48-58
• 参考文献53-58
• 致谢58-59
• 个人简历59

【参考文献】

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本文编号：407167