ANKIB1对SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及CnAα4的功能分析

发布时间：2017-06-16 17:06

  本文关键词：ANKIB1对SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及CnAα4的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景神经退行性疾病的治疗在临床上缺少有效的方法,因此需要寻找新的与神经保护相关的分子靶点。钙调神经磷酸酶(calcineurin, CN)是目前唯一受Ca2+和钙调蛋白(calmodulin, CaM)调控的蛋白磷酸酶,由催化亚基CnA和调节亚基CnB组成,能够活化活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT),与细胞凋亡有着密切的关系。含锚蛋白重复序列和IBR结构域蛋白1(ankyrin repeat and IBR domain containing 1, ANKIB1)含有一个CN的结合位点,其与细胞凋亡之间的关系尚缺乏研究。CnAa4是一种新的人CnAl转录本,其编码蛋白的功能未见报道。目的1、探索ANKIB1对SH-SY5Y细胞凋亡的影响及可能机制；2、揭示CnAa4的功能。方法1、Western印迹检测ANKIB1对SH-SY5Y细胞凋亡的影响将pCMV-Myc-ANKIB1转染SH-SY5Y细胞后,向培养液中加入百草枯,western印迹检测细胞裂解液中活化的caspase3、失活的PARP和p-IκB的水平。2、ANKIB1与CaM的关系首先用pull down和Co-IP证明ANKIB1与CaM相互作用,然后调整反应体系中游离的Ca2+浓度,研究Ca2+对二者相互作用的影响。将pFLAG-CMV-CaM和pCMV-Myc-ANKIB1共转染HEK293T细胞,48 h后对qPCR和western印迹分析CaM对ANKIB1基因表达的影响。蛋白质稳定性实验研究CaM对ANKIB1蛋白稳定性的影响。3、双荧光素酶报告基因分析ANKIB1对NFAT转录因子活性的影响将pCMV-Myc-ANKIB1转染HEK293T细胞,24 h后向培养液中加入离子霉素(2μ.M)或者环孢菌素A(2μM)处理6 h,然后双荧光素酶报告基因分析ANKIB1对NFAT转录因子活性的影响。4、CnAa4功能鉴定Pull down检测CnAa4与CaM的结合能力,免疫荧光分析CnAa4对NFAT核转位的影响,双荧光素酶报告基因分析CnAa4对NFAT转录因子活性的影响。结果1、转染pCMV-Myc-ANKIB1的SH-SY5Y细胞经百草枯处理之后活化的caspase3和失活的PARP水平较对照组均有所降低；2. ANKIB1与CaM相互作用,不同浓度的Ca2+CaM-agarose上结合的ANKIB1的量有差别,CaM通过增强ANKIB1的蛋白质稳定性来调节ANKIB1基因的表达；3、ANKIB1能够抑制NFAT的转录因子活性；4、CnAa4具有与CnAal相似的CaM亲和力,能够促进NFATc1的核转位,较CnAα1有更强的激活NFAT转录因子活性的能力。结论1、ANKIB1与CaM相互作用,抑制NFAT的转录因子活性,对百草枯诱导的SH-SY5Y细胞凋亡有保护作用。2、CnAa4和CnAα1有相似的CaM亲和性,具有比CnAα1更强的磷酸酶活性。
【关键词】：ANKIB1 细胞凋亡 NFAT CnAα4 功能
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第一部分 ANKIB1对SH-SY5Y细胞凋亡的影响11-25
• 1 材料和方法11-15
• 2 结果15-22
• 3 讨论22-25
• 第二部分 CnA-α4的功能分析25-31
• 1 材料和方法25-26
• 2 结果26-28
• 3 讨论28-31
• 结论31
• 参考文献31-34
• 综述 NFAT的调节及其功能34-46
• 参考文献40-46
• 附录46-50
• 攻读学位期间发表文章情况50-51
• 致谢51-53
• 个人简历53

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