牛骨Ⅰ型胶原蛋白提取及结构表征

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※工艺技术

食品科学

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牛骨Ⅰ型胶原蛋白提取及结构表征
刘丽莉 1 , 2 ，马美湖 1 , * ，杨协力 2
(1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 摘 430070；2. 河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳

471003)

要：针对牛骨胶原蛋白提取的工艺( 脱脂、脱钙、提取介质) 和结构表征进行研究。结果表明：最佳的提取工

艺条件：采用乙醚低温回流脱脂，0.48% 盐酸脱钙，骨粒径为 5mm × 10mm ，以 1% 柠檬酸和 1% 胃蛋白酶复合 为提取介质。纯化后的牛骨胶原蛋白通过紫外扫描分析、FT-IR、DSC 热收缩温度和 SDS-PAGE 凝胶电泳的测定， 并与标准牛腱Ⅰ型胶原蛋白比较，确定所提蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白，达到了电泳纯，且较好地保持了Ⅰ型胶 原的 3 股螺旋结构。 关键词： 牛骨；Ⅰ型胶原蛋白；提取；SDS-PAGE 电泳；差示扫描量热法(DSC) ；傅里叶红外光谱

Extraction and Characterization of Type Ⅰ Collagen from Bovine Bone
LIU Li-li 1,2，MA Mei-hu 1,*，YANG Xie-li 2 (1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China； 2. Department of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China) Abstract：In the present study, critical process steps for extracting type Ⅰ collagen from bovine bone, such as defatting, decalcification and extraction medium selection were optimized. Along with this, purified collagen was analyzed through SDSPAGE, UV, FT-IR and DSC, and compared with the standard of calf-tendon type I collagen. Results indicated that the optimal extraction process was based on low-temperature ethyl ether reflux defatting and decalcification of bovine bone powder with a particle size of 5 × 10 mm using 0.48% hydrochloric acid, followed by extraction using a mixed solution simultaneously containing 1% citric acid and 1% pepsin. The extracted collagen was identified as type I collagen and the purity reached electrophoretic grade. Furthermore, the unique triple helical structure of type I collagen remained very well. Key words：bovine bone；type Ⅰ collagen；extraction；SDS-PAGE；differential scanning calormetry (DSC)； Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR) 中图分类号：TS251 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)02-0087-05

胶原是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富 的蛋白质，占总蛋白质量的 25% ～33% ，广泛存在于动 物的皮肤、肌腱、骨骼中，其提取制品已广泛应用于 医药、保健、食品加工、化妆品等众多领域。迄今 为止，在遗传学上已定义了 1 8 种独特的胶原类型，其 中Ⅰ型胶原是骨、皮肤、筋键等的优势蛋白，占生物 体胶原总量的 9 0 % 。人们对Ⅰ型胶原的研究最多，其 在生物材料中的应用也最为广泛 [1-3] 。 Ⅰ型胶原是动物体内含量最多的一类胶原蛋白，其 在组织工程领域应用也最为广泛。使得从动物组织内提 取Ⅰ型胶原成为近年的研究热点。牛骨中含有丰富的Ⅰ

型胶原蛋白和钙、磷等矿物质，牛骨总质量的 20%～30% 为蛋白质，主要为胶原蛋白，可见牛骨是非常好的胶原 蛋白生产原料。目前国内外对从牛骨肌腱和软骨中提取 胶原蛋白的工艺已较成熟，并已运用于工业化生产 [ 4-7] 。 而针对牛骨胶原蛋白的研究却很少。我国牛骨的产量丰 富，为了更有效地促进畜产加工废弃物的综合利用、降 低骨骼加工的成本，开发新型胶原蛋白资源。本研究 考察牛骨胶原提取前处理工艺 ( 脱脂和脱钙 ) ，并针对提 取的胶原蛋白进行相关的结构表征。 1 材料与方法

收稿日期：2009-03-04 基金项目： “十一五”国家科技支撑计划项目 (2006BAD05A16) 作者简介：刘丽莉 ( 1 9 7 4 — ) ，女，讲师，博士研究生，主要从事生物技术与动物性食品科学研究。 E-mail：yangliuyilang@126.com * 通信作者：马美湖 ( 1 9 5 7 — ) ，男，教授，博士，主要从事肉类、蛋品科学理论与技术研究。 E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn

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材料与试剂 牛长骨购买于华中农业大学菜市场。

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分沉淀，以 8500r/min 离心 20min ，用 0.5mol/L 的冰 醋酸重新溶解。重复盐析一次，离心后得沉淀，再 用 0.5mol/L 冰醋酸溶解，于蒸馏水透析 2 ～3d ，每隔 4h 更换 1 次水，透析好后冷冻干燥得纯胶原样品。胶原蛋 白得率计算公式为：
纯化所得的胶原蛋白的总质量 胶原蛋白得率/%＝——————————————×100 牛骨蛋白质的总质量

甲叉双丙烯酰胺 (Fluka 分装 ) ；牛腱Ⅰ型胶原蛋白 ( 生化级， Sigma 分装 )；高分子质量蛋白质标准品 (14000kD)；其他试剂( 均为分析纯) 1.2 仪器与设备 Avanti J-E 超速冷冻离心机 公司；UV1800 紫外分光光度仪 470FT-IR 红外光谱仪 差示扫描量热仪 1.3 北京市六一仪器厂。 牛骨胶原蛋白的提取
[8-9]

北

京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；透析袋 国药集团。

美国 Beckman Coulter 美国 MAPADA 公司； 1.4

牛骨基本成分的测定[10-11] 灰分：马福炉法；粗蛋白质：凯氏定氮法；粗脂

美国 Nicolet 公司；DSC204F1

德国 NETZSCH 公司；DYY-12 电泳仪

肪：索氏抽提法；胶原蛋白含量：采用分光光度法测 定原料骨中羟脯氨酸含量的方法。 1.5 法
[12]

钙含量测定 骨料浸酸溶液中钙含量的测定采用 E D T A 滴定 ：取浸酸溶液 1mL ，加水 9mL ，分别加入 3mL 三

实验所有提取条件的选择都以等量牛骨提取得到胶 原蛋白的质量作为指标。由于胶原蛋白容易变性，实 验操作都在 1 0 ℃左右进行。 1.3.1 成品 1.3.2 脱脂处理 破碎的牛骨经水洗后，部分脂肪被洗掉，残余的 脂肪分别采用不同的脱脂方法 ( 正己烷、石油醚及乙醚 静置浸泡脱脂、乙醚低温回流脱脂 )，确定最佳的方法。 脂肪残留率 ( 残油率 ) 的计算公式为： 脱脂后牛骨残留的脂肪质量 残油率 /% ＝——————————————× 100 脱脂前的牛骨总脂肪质量 1.3.3 脱钙处理 采用稀盐酸溶液脱除骨料中的钙。研究不同的盐酸 浓度(0.24、0.48、0.60mol/L)、粒径(3mm × 5mm、5mm × 10mm、10mm × 15mm、15mm × 25mm) 对钙溶出量 的影响，通过测定浸酸溶液中钙离子的含量，确定合 适的浸酸脱钙条件。脱钙量的计算公式为：
盐酸溶液中所含的钙离子的总质量 脱钙量/(mg/mL)＝———————————————— 盐酸的体积

乙醇 胺 和 5 m L 氨性 溶 液 ，两滴 铬 黑 指示 剂 ，以标 准 EDTA 溶液滴定到溶液由紫蓝色转为蓝色。根据标准回 归方程求解浸酸溶液中钙含量。 1.6 牛骨胶原蛋白的结构表征[8-9,13-14] 紫外扫描分析：室温条件下，以 0.5mo l/L 醋酸为 溶剂溶解胶原蛋白，样品于紫外 - 可见光扫描仪上进行 200 ～300nm 波长范围内扫描。 红外光谱分析：将一定量干燥后的 KBr 和冷冻干燥 后的胶原蛋白样品置于玛瑙研钵中，研磨均匀，尽量 成粉末状，装样，手动压片，取出样品小心轻放入样 品室。采用傅里叶变换红外光谱仪对样品在 4 0 0 ～ 4000cm -1 区间扫描。 热收缩温度的测定：采用差示扫描量热法 ( D S C ) 。 称取 5 ～6mg 样品，放入 DSC 铝坩锅中，铝坩锅加盖密 封后，以空铝坩锅作为参比。 25 ℃保持 1min ，从 25 ℃ 升温到 120 ℃，升温速率为 5 ℃/min ，120 ℃保持 1min 。 分子量的测定：采用 SDS-PAGE 垂直电泳法。15% 的分离胶、 5 % 的浓缩胶；电泳缓冲液为 T r i s - 甘氨酸 缓冲液 (pH8.3 ， 0.1% SDS)；样品缓冲液为 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液；0.25% 考马斯亮兰 R-250 甲醇水 染色液。采用直流恒压电源，浓缩胶为 1 0 0 V ，分离胶 为 1 6 0 V ，电泳时间 3 ～ 4 h 。

提取工艺流程 牛长骨→修整、清洗→破碎→脱脂→脱钙→纯化→

1.3.4

提取介质的选择 将脱钙牛骨粉碎后，采用不同的提取介质为 0.5mol/L 2 2.1 结果与分析 骨料脱脂
表1 Table 1 处理 牛长骨(原料) 经水洗骨 脱脂后骨 牛长骨的主要成分及质量分数 Main components of bovine bone 粗脂肪 /%(干基) 18.45 9.87 0.050 总灰分 /% 53.12 57.34 68.54

的醋酸、0.01mol/L 盐酸、1% 柠檬酸 +1% 胃蛋白酶(m/V)， 料液比为 1:8(mg/mL) ，后于 4 ℃条件下提取 72h ，两层 纱布过滤，滤液以 8500r/min 离心 20min ，得到酸溶性 胶原蛋白粗制液，比较提取效果。 1.3.5 胶原蛋白得率的测定 向粗制液中加入 NaCl 固体并不停搅拌，使浓度达 到 2mol/L ，然后在 4 ℃条件下静置过夜，使胶原蛋白充

粗蛋白 /% 22.28 21.11 23.14

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牛长骨含有约 18.45% 的脂肪( 表 1) 。脂肪的存在明 显影响提取胶原蛋白的品质，同时可能使蛋白产生异 味。经流动水清洗后的碎骨料采用不同方法脱脂，结 果见图 1 。
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

由于化学反应速度受反应中浓度较小的底物所控 制。在盐酸与钙盐的化学反应中，盐酸的量相对较小 而磷酸钙和碳酸钙过量，因而反应受盐酸的浓度控制。 根据文献报道 [ 6 ] ，为了避免骨料中的有机成分遭到破 坏，盐酸浓度选定为 0.24 ～ 0.60mol/L 。
14 12 10 8 6 4 2 0 1
0.24mol/L 0.48mol/L 0.60mol/L

残油率 /%

A

B

C

D

E

F

处理方式 A . 原料骨；B . 水洗骨；C . 正己烷静态浸泡；D . 石油 静醚态浸泡；E . 乙醚静态浸泡；F . 乙醚低温回流。 图1 Fig.1 碎骨料不同脱脂方法的效果比较 Fig.3 bovine bone

脱钙量 /(mg/mL)

2

3

4

5

6

7

8

浸提次数 图3 盐酸浓度对骨脱钙量的影响

Comparison of defatting efficiency of different methods on

Effect of HCl concentration on decalcification

由图 3 可知，随着浸酸液的更换，液体中钙含量 从图 1 可知，几种脱脂方法都可使残油率降低，但 降低的程度不同。正己烷、石油醚、乙醚浸泡脱脂尽 管使脂肪的残油率下降的幅度较大，但耗时长达 4 8 h 。 而采用乙醚低温回流脱脂，脱脂效果相当明显，可以 使残油率降低至 0.05% ，因此，最终选择低温乙醚回流 脱脂方法。 2.2 骨料脱钙 脱脂后的骨料中无机矿物质含量高达 68.54%，欲从 骨骼中获得纯胶原，需要除去骨料中的无机矿物质。骨 料中的无机物主要是磷酸三钙和碳酸钙，由于盐酸、磷 酸等可以与磷酸三钙和碳酸钙反应生成可溶性的钙盐而 游离出骨料，因此工业上普遍采用盐酸、磷酸溶出骨 料中的无机物，这个过程称为浸酸。本研究采用更换 盐酸的办法除去磷酸盐。 以 E D T A 标准溶液滴定钙标准溶液，得到滴定体 积 y (mL) 与钙质量浓度 x (mg/mL) 的关系，结果见图 2 。 通过线性回归得到标准方程为：y ＝ 1.016 x － 0.179( R 2 ＝ 0 . 9 9 9 8) ，由此关系式计算出脱钙量。
60 50 40 30 20 10 0 － 10 0 EDTA 滴定的体积 /mL y ＝ 1.016x － 0.179 R2 ＝ 0.9998 脱钙量 /(mg/mL) 20 15 10 5 0 2 4 6 8 时间 /h 图4 骨粒径对骨脱钙量的影响 10 12 14
3×5 m m 5×10mm 10×15mm 15×25mm

逐渐减少，最终趋于平缓，浸酸接近终点；而且随着 浸酸液盐酸浓度越大，溶液中脱出钙量也越大。将盐 酸浓度 0.48mol/L 和 0.60mol/L 的脱钙量相比较，两者没 有很大区别，且最终均趋于平衡，因此，从工业生产 考虑，选用 0.48mol/L 盐酸浓度。 2.2.2 骨粒径对脱钙量的影响

Fig.4 Effect of particle size of bovine bone powder on decalcification

由图 4 可知，骨钙的溶出速度随骨料粒径的减小而 明显增大。但当骨粒径过小过细时反而容易在更换酸液 时随废液排出而损失。因此，实验采用 5mm × 10mm 骨 粒径。 2.3 提取介质的选择
表2 胶原蛋白提取介质的选择

10

20

30

40

50

Table 2

Comparison of collagen yield from bovine bone using different extraction media

钙质量浓度 /(mg/mL) 图2 Fig.2 钙离子滴定标准曲线 指标 胶原蛋白得率/%

0.01mol/L 盐酸 2.8

0.5mol/L 醋酸 3.0

1% 柠檬酸 +1% 胃蛋白酶 5.6

Standard curve of calcium ion titration

2.2.1

盐酸浓度对脱钙量的影响

以胶原蛋白得率为指标考察提取介质的影响，传统

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的胶原蛋白所用的提取介质为 0.01mol/L 盐酸或 0.5mol/L 醋酸，本实验选用 1 % 柠檬酸和 1 % 胃蛋白酶结合的方 法进行提取，结果见表 2 。 2.4 2.4.1 胶原蛋白结构表征 牛骨胶原蛋白的紫外光谱分析 将提取的胶原蛋白和牛腱Ⅰ型胶原蛋白样品在紫外 可见光描仪上进行 200 ～ 300nm 波长范围内扫描，结果 见图 5 。
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
提取牛骨 胶原蛋白 牛腱Ⅰ型 胶原蛋白

的牛骨胶原酰胺Ⅱ带的特征吸收为 1545cm -1 。由于胶原 蛋白的甘氨酸和特征氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸含量高， 且形成独特序列(Gly-Pro-Hyp)n，使得胶原蛋白在 1200～ 1400cm -1 光谱内具有其他蛋白所没有的红外光谱特征。 由 C — N 伸缩和 N — H 弯曲引起的酰胺Ⅲ带出现在 1200～ 1360cm-1 谱带，归属于 Gly 骨架和 Pro 侧链的 CH2 摇摆振 动峰的体现。1238cm-1 为提取牛骨胶原蛋白 N — H 弯曲 引起的酰胺Ⅲ带的特征频率。 2.4.3 牛骨胶原蛋白热收缩温度的分析 在天然状态下，，胶原是一个较刚硬的类棒状分子， 它是由三条肽链缠绕成的一个超螺旋结构。它变性的结 果为形成三条肽链，而且成随机卷曲状态，因此胶原 的热变性过程是在一个较窄的温度间隔内其三股螺旋的 解缠绕过程。胶原蛋白的热变性温度是反映其天然螺旋

吸光度

220 228 236 244 252 260 268 276 284 波长 /nm 图5 Fig.5 牛骨酸溶性胶原蛋白紫外扫描图 UV scanning spectra of extracted collagen of bovine bone and calf-tendon type I collagen standard

结构的一项重要指标，同时也反映胶原蛋白的生物活 性。当体系温度达到 T s 时，胶原分子从伸展的纤维态 转变为无规则卷曲状。图 7 将牛腱Ⅰ型胶原的 DSC 图谱 与所提取胶原的 DSC 图谱对比可以看出：两者的热变性 温度 T s 分别为 69.1 ℃和 68.8 ℃，两者基本接近，表明牛 骨胶原蛋白样品较好的保持了胶原蛋白的三螺旋结构。
69.1℃

胶原蛋白所特有的吸收峰一般在 230nm 左右。由图 5 可知，所提取的牛骨胶原蛋白和牛腱Ⅰ型胶原蛋白溶 液分别在 228nm 和 230nm 波长处有一个强吸收峰，符合 是氨基酸组成和结构存在一定差别。 2.4.2 牛骨胶原蛋白的傅里叶红外分析
58 56 54 52 50 48 46 44 42 40 38 36 4000
牛腱Ⅰ型 胶原蛋白 提取牛骨 胶原蛋白

DSC/(mW/mg)

上述特性。但两者最大吸收峰有些差别，可能的原因

0.28 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 40 60 a.牛腱Ⅰ型胶原蛋白 温度 /℃ 80

透光率 /%

2929.25

1545.44 1451.03 1397.94 1238.35

3000

2000 波数 /cm
-1

1000

图6 Fig.6

牛骨酸溶性胶原蛋白红外扫描图

FT-IR spectra of extracted collagen of bovine bone and calf-tendon type I collagen standard

0.28 0.26 0.24 0.22 0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 20 40

68.8℃

3330.40

1658.77

DSC/(mW/mg)

60 温度 /℃

80

由图 6 可知，牛骨胶原蛋白和牛腱Ⅰ型胶原蛋白的 红外图谱几乎重合，说明两者微观结构有很大的相似 性。由此可以基本确定所提牛骨胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋 白。牛骨胶原蛋白在 3400cm -1 附近为酰胺 A ，呈现出蛋 白质的特征吸收。由于大部分的胶原蛋白的酰胺Ⅰ带在 1 6 5 0 ～ 1 6 5 5 c m - 1 ，实验提取的牛骨胶原蛋白出现在 1653cm -1 ，说明牛骨胶原蛋白保留了大量的三股螺旋结 构。酰胺Ⅱ带的特征吸收频率为 1480 ～1600cm ，主要
-1

b.提取的牛骨胶原蛋白 图7 牛骨胶原蛋白 DSC 曲线图 Fig.7 DSC curves of calf-tendon type I collagen standard and extracted collagen of bovine bone

2.4.4

牛骨胶原蛋白的电泳分析 如图 8 所示，从胶原的 SDS-PAGE 凝胶电泳图谱可

以 清 晰 地 看 到 3 条 电 泳 带 ， 从 上 到 下 依 次 为 β链 ( 约 210kD) 、 α1 链 ( 约 118kD) 、 α2 链 ( 约 110kD) ，图谱上 无其他杂带，可见所提胶原蛋白纯度较高，达到了电

为胶原蛋白的 C — N 伸缩与 N — H 弯曲的反映，提取

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参考文献：
[1]

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泳纯。因此，推断提取的胶原蛋白基本保持了完整的 三股螺旋结构。
β
1 200kD → 2

[2] [3]

α1
→ →

130kD

→

α2

[4]

97.4kD

→ [5]

1. 高分子质量标准蛋白 Marker ；2. 提取牛骨胶原蛋白。 图8 Fig.8 SDS-PAGE 凝胶电泳

[6]

SDS-PAGE profile of extracted collagen of bovine bone

[7]

3 3.1

结

论

[8] [9] [10] [11] [12] [13]

本实验针对传统提取胶原蛋白加以改进，确定了

提取牛骨胶原蛋白的工艺条件：脱脂采用乙醚低温回流 抽提可以除去绝大部分脂肪，脂肪的残留率为 0.05% ； 采用盐酸脱钙的条件为：0.48mol/L 盐酸，骨粒径为 5mm × 10mm，提取胶原的介质为 1% 柠檬酸和 1% 胃蛋白酶 复合液。 3.2 通过紫外扫描、FT-IR 、DSC 和 SDS-PAGE 凝胶 电泳分析，与牛腱Ⅰ型胶原蛋白标准对照，确定所提 牛骨胶原蛋白为典型的Ⅰ型胶原蛋白，较好的保持了胶 原蛋白的三螺旋结构，且达到了电泳纯。

[14]

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