浓缩生长因子纤维蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及分化的影响

发布时间：2016-11-07 15:23

  本文关键词：浓缩生长因子纤维蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及分化的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

《山东大学》 2015年

浓缩生长因子纤维蛋白对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及分化的影响

狄婧  

【摘要】：目的：浓缩生长因子纤维蛋白(Concentrated Growth Factors, CGF)为自体血经不间断差速离心制备而成的富含多种高浓度生长因子的纤维蛋白,具有促进细胞增殖、分化、趋化和刺激血管化的功能,能够加速软硬组织修复,是再生医疗领域中的新技术。本实验以体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞作为研究对象,观察CGF对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及分化的影响,为CGF作为骨组织工程的生长因子源提供论实验依据。方法：1、大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养选取健康的4周龄雄性Wistar大鼠,在无菌条件下取其双侧胫骨和股骨,通过全骨髓贴壁法对大鼠骨髓间充质干细胞进行分离、纯化,收集第2-4代细胞用于后续实验。2、大鼠骨髓间充质干细胞的鉴定(1)倒置相差显微镜观察细胞形态。(2)采用免疫组化染色对细胞表面标志物CD34、CD44进行鉴定。3、CGF的制备选取健康的4周龄雄性Wistar大鼠,每只采集静脉血各5ml,放入真空采血管中,分别置于Medifiuge离心加速机的转筒中,按照制备程序,制备出CGF。4、实验分组①细胞增殖分为两组：按基础培养基中加入CGF与否,分为基础培养基+CGF组和基础培养基组(对照组),并选择4个时间点(1d、3d、5d、7d)分别对比观察两组细胞增殖情况。②细胞分化分为四组：基础培养基+CGF组、矿化诱导液组、矿化诱导液+CGF组和基础培养基组(对照组),同样选择7d和14d两个时间点,对比观察各时间点骨髓间充质干细胞成骨诱导情况。5、应用MTT方法检测CGF对大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。6、应用碱性磷酸酶试剂盒检测成骨诱导各组细胞的碱性磷酸酶活性。7、成骨诱导14天后,对实验各组进行茜素红染色和钙化颗粒的半定量分析。8、应用实时定量PCR的方法对大鼠骨髓间充质干细胞进行成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、I-型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)mRNA表达量的检测。9、统计学分析所有实验数据均采用SPSS17.0统计软件进行分析,数据结果均以均数±标准误表示,以P0.05认为具有统计学意义。结果：1、本研究成功地应用全骨髓贴壁法在体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞大部分为长梭形,生长速度快,并以漩涡状分布。免疫细胞化学染色显示CD44染色阳性,CD34染色阴性。2、离心后,可见真空采血管中血液分为三层,顶层为贫血小板血浆,底部是红细胞层,两者之间为纤维蛋白凝胶层即CGF。3、MTT结果显示：经过统计学分析,在第1天和第3天,基础培养基+CGF组和对照组的吸光度值无显著性差异(P0.05)；在第5天和第7天,基础培养基+CGF组的吸光度值高于对照组,经过统计学分析存在显著性差异(P0.05)。4、碱性磷酸酶结果显示,在第7天和14天,矿化诱导液+CGF组的ALP活性均高于其余三组,矿化诱导液组次之,对照组的ALP活性最低,各组间两两比较,差异具有统计学意义(P0.05)。5、茜素红染色及钙化颗粒的半定量分析：成骨诱导14d后,在倒置显微镜下能观察到矿化颗粒的形成,并且矿化诱导液+CGF组所形成的颗粒数量最多,而对照组即基础培养基组的矿化颗粒最少。此外,矿化颗粒经氯化十六烷基吡啶溶解后,各组吸光度值(以均数±标准误表示)：基础培养基+CGF组,0.6914±0.0136；矿化诱导液组,1.1607±0.0651；矿化诱导液+CGF组,1.6685±0.0211；对照组,0.2102±0.0231,各组间两两比较,差异具有统计学意义(P0.05)6、RT-PCR结果显示,BMSCs在经过诱导7d、14d后,矿化诱导液+CGF组的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN等成骨相关基因的mRNA表达均明显高于其它三组(P0.05)。无论是诱导培养7d还是14d,各组ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN的mRNA表达量均以矿化诱导液+CGF组最高,矿化诱导液组次之,基础培养基+CGF组再次之,对照组即基础培养基组最低,各组间两两比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论：1、本实验成功分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。通过免疫细胞化学染色鉴定,验证了所得细胞为间充质干细胞。2、CGF能明显促进大鼠骨髓间充质干细胞体外的早期增殖。3、CGF可以加强成骨诱导培养基的成骨诱导能力,同时,其单独应用亦具有一定的成骨诱导能力。4、CGF制取简单,成本较低,因其含有大量细胞因子,有望作为骨组织工程的生长因子源,刺激种子细胞增殖分化。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R783.1
【目录】：

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本文编号：167031