D打印技术的软骨修复及软骨下骨重建

  本文关键词：基于3-D打印技术的软骨修复及软骨下骨重建，由笔耕文化传播整理发布。

?318?

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, March 2014, Vol. 28, No.3

基于3-D打印技术的软骨修复及软骨下骨重建

23 连芩1 李涤尘1 王坤正2 靳忠民1， 张维杰1，

边卫国4 刘亚雄1 贺健康1 王玲1

【摘 要】 目的 基于3-D打印技术探索骨软骨组织工程修复过程中，新生软骨下骨微结构参数变化规律及其与软骨修复间关系，为功能化组织工程软骨构建奠定基础。 方法 应用3-D打印技术制备双相聚乙二醇/β-磷酸三钙骨软骨复合支架。取40只6月龄雄性新西兰白兔（体重2.5～3.5 kg），于右膝滑车部位建立直径4.8 mm、深7.5 mm骨软骨缺损模型，左侧不制备缺损为假手术组；将支架分别植入35只兔骨软骨缺损作为实验组，余5只不植入支架作为空白对照组。实验组和假手术组分别于术后1、2、4、8、16、24、52周，空白对照组于术后24周取材（n=5），行大体及组织学观察，并根据Wayne评分体系进行评分；行Micro-CT扫描及三维重建检测新生软骨下骨微结构参数：骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）、骨表面积分数（bone surface area fraction，BSA/BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）及骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb.Sp）。采用Pearson相关分析软骨下骨微结构参数与软骨修复大体及组织学评分间的相关性。 结果 实验组术后软骨明显修复，52周时以透明软骨为主，出现潮线结构；Wayne评分显示，实验组24、52周评分均显著高于16周（P < 0.05），24周及52周间差异无统计学意义（P > 0.05）；但各时间点实验组评分均低于假手术组（P < 0.05）。实验组修复的软骨下骨逐渐从缺损周围向中央迁移，24、52周时形成软骨下骨板结构。修复术后BV/TV、BSA/BV、Tb.N均呈“双峰”样变化过程，分别在2、16周达峰值；Tb.Sp变化规律与BV/TV、BSA/BV、Tb.N相反；Tb.Th整个过程中变化不明显。相关分析显示：BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp与软骨修复大体及组织学评分之间均存在相关关系。 结论 在兔绝对尺寸骨软骨缺损修复中，软骨下骨微结构参数与软骨修复存在相关关系；完整的软骨下骨修复需经历“增殖-重建-再增殖-再重建”的“双峰”样过程，2、16周是骨增殖的2 个关键时期。

【关键词】 3-D打印技术 组织工程软骨 软骨下骨 微结构参数 软骨修复 兔

CARTILAGE REPAIR AND SUBCHONDRAL BONE RECONSTRUCTION BASED ON THREE-DIMENSIONAL PRINTING TECHNIQUE/ZHANG Weijie1, 2, LIAN Qin1, LI Dichen1, WANG Kunzheng2, JIN Zhongmin1, 3, BIAN Weiguo4, LIU Yaxiong1, HE Jiankang1, WANG Ling1. 1State Key Laboratory for Manufacturing Systems Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an Shaanxi, 710049, P.R.China; 2the First Department of Orthopaedics, the Second Affi liated Hospital, Xi’an Jiaotong University;

3

Institute of Medical and Biological Engineering, Leeds University, UK; 4Department of Orthopaedics, the First Affi liated Hospital, 【Abstract】 Objective To investigate whether subchondral bone microstructural parameters are

Xi’an Jiaotong University. Corresponding author: LIAN Qin, E-mail: lqiamt@mail.xjtu.edu.cn

related to cartilage repair during large osteochondral defect repairing based on three-dimensional (3-D) printing technique. Methods Biomimetic biphasic osteochondral composite scaffolds were fabricated by using 3-D printing technique. The right trochlea critical sized defects (4.8 mm in diameter, 7.5 mm in depth) were created in 40 New Zealand white rabbits (aged 6 months, weighing 2.5-3.5 kg). Biomimetic biphasic osteochondral composite scaff olds were implanted into the defects in the experimental group (n=35), and no composite scaff olds implantation served as control group (n=5); the left side had no defect as sham-operation group. Animals of experimental and sham-operation groups were euthanized at 1, 2, 4, 8, 16, 24, and 52 weeks after operation, while animals of control group were sampled at 24 weeks. Subchondral bone microstructural parameters and cartilage repair were quantitatively analyzed using Micro-CT and Wayne scoring system. Correlation analysis and regression analysis were applied to reveal the relationship between subchondral bone parameters and cartilage repair. The subchondral bone parameters included bone volume fraction (BV/TV), bone surface area fraction (BSA/BV), trabecular

DOI：10.7507/1002-1892.20140072

51375371、50775178、51323007）基金项目：国家自然科学基金资助项目（51075320、；中央高校基本科研业务费专项资金；西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室科研资金

1西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室710049）2西安交通大学第二附属医院骨一科；3英国利兹大学医学与生物作者单位：（西安，；4西安交通大学第一附属医院骨科工程研究所；

3-D打印与仿生制造，E-mail: lqiamt@mail.xjtu.edu.cn通讯作者：连芩，副教授，硕士生导师，研究方向：

2014-2-21 16:10:17；网络出版时间：网络出版地址：

中国修复重建外科杂志2014年3月第28卷第3期

?319?

thickness (Tb.Th), trabecular number (Tb.N), and trabecular spacing (Tb.Sp). Results In the experimental group, articular cartilage repair was signifi cantly improved at 52 weeks postoperatively, which was dominated by hyaline cartilage tissue, and tidal line formed. Wayne scores at 24 and 52 weeks were signifi cantly higher than that at 16 weeks in the experimental group (P < 0.05), but no signifi cant diff erence was found between at 24 and 52 weeks (P > 0.05); the scores of experimental group were signifi cantly lower than those of sham-operation group at all time points (P < 0.05). In the experimental group, new subchondral bone migrated from the surrounding defect to the centre, and subchondral bony plate formed at 24 and 52 weeks. The microstructural parameters of repaired subchondral bone followed a “twin peaks” like discipline to which BV/TV, BSA/BV, and Tb.N increased at 2 and 16 weeks, and then they returned to normal level. The Tb.Sp showed reversed discipline compared to the former 3 parameters, no signifi cant change was found for Tb.Th during the repair process. Correlation analysis showed that BV/TV, BSA/BV, Tb.Th, Tb.N, and Tb.Sp were all related with gross appearance score and histology score of repaired cartilage. Conclusion Subchondral bone parameters are related with cartilage repair in critical size osteochondral repair in vivo. Microstructural parameters of repaired subchondral bone follow a “twin peaks” like discipline (osteoplasia-remodeling- osteoplasia-remodeling) to achieve reconstruction, 2nd week and 16th week are critical time points for subchondral bone functional restoration.

【Key words】 Three-dimensional printing technique Tissue engineered cartilage Subchondral bone Microstructural parameter Cartilage repair Rabbit

Foundation items: National Natural Science Foundation of China (51075320, 51375371, 50775178, 51323007); Fundamental Research Funds for the Central Universities; Research Funds of State Key laboratory for Manufacturing Systems Engineering of Xi’an Jiaotong University

经既往几十年努力，软骨修复取得了长足进步，但仍与功能化修复有很大距离[1-3]。研究表明，软骨和软骨下骨是一整体，前者起负载作用，后者起力学支撑与吸收冲击力作用，二者相互依赖、不可分割[4]。软骨再生不应只限于软骨修复，为达到功能化修复，需注意软骨下骨对软骨修复的影响，但其在软骨修复中的作用尚不明确[5]。因此，本研究建立兔骨软骨绝对尺寸缺损模型，植入仿生设计并采用3-D打印技术制造的骨软骨复合支架，探讨骨软骨修复过程中软骨下骨重建、微结构参数变化规律，以及与软骨修复的关系，为软骨的功能化修复奠定基础。1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

6月龄雄性新西兰白兔40只，，体重2.5～3.5 kg，由西安交通大学实验动物中心提供。所有动物实验均获西安交通大学实验动物管理委员会同意，实验实施

[6]遵循《实验动物保护与应用指南》。

（Siemens公司，德国）；Mimics13.0软件（Materialize公司，比利时）。

1.2 骨软骨复合支架制备

按既往研究方法[7-8]，应用3-D打印技术制备仿生双相支架。操作步骤：采用凝胶注模和烧结方法制备外形匹配的β-TCP陶瓷支架，弹性模量达（12.6 ± MPa；通过调整曝光时间与PEG浓度，以I-11730.3）

为引发剂，逐层打印，获得与软骨弹性模量相匹配的将PEG水凝胶直接成型于制备的PEG水凝胶支架[9]，

β-TCP陶瓷支架上，形成外形匹配、力学性能仿生的双相PEG/β-TCP骨软骨复合支架（图1）。1.3 骨软骨缺损模型建立及支架植入

取40只新西兰白兔，腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉后，无菌条件下，通过右侧股内侧切口，于右膝滑车部位建立直径4.8 mm、深7.5 mm的骨软骨绝对尺寸缺损模型（图2 a）；左侧不制备缺损，仅行切开缝合手术处理，作为假手术组。将35个双相PEG/β-TCP骨软骨复合支架，分别植入35只实验动物骨软骨缺损内（实验组），支架距离关节表面0.5 mm；余5只缺损不作处理，作为空白对照组；逐层（图 2 b）

关闭切口。实验组和假手术组分别于1、2、4、8、16、24、52周，空白对照组于24周过量注射3%戊巴比妥钠处死动物，各取5个标本进行以下观测。1.4 观测指标

1.4.1 大体观察 取实验组和假手术组术后16、24、52周及空白对照组术后24周标本（n=5），对软骨修复

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）400（相对分子质量508；天津市天骄化工有限公司）；双丙烯酸酯单体（上海宝曼生物科技有限公司）；引发剂2-羟基-甲基苯基丙烷-1-酮（I-1173；陕西化玻器械有限公司）；无水乙醇、戊二醛（天津科密欧化学试剂有限公司）；β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）陶瓷（上海贝奥路生物材料有限公司）。SPS150B 光固化快速成型机（陕西恒通智能机器有限公司）；Inveon Micro-CT

?320?

Chinese Journal of Reparative and Reconstructive Surgery, March 2014, Vol. 28, No.3

的中长期情况进行大体观察。根据Wayne评分体系[10]，从新生软骨缺损覆盖范围、颜色、缺损边界及表面情况4个方面进行评分，总分16分。由3位专业技术人员双盲条件下实施。

1.4.2 组织学观察 取实验组和假手术组术后16、24、52周及空白对照组术后24周标本（n=5），行组织学观察。将标本置于10%甲醛固定48 h，于10%EDTA中脱钙2～3个月，石蜡包埋、4 μm厚薄层切片，行番 红 O/快绿染色。根据Wayne评分体系[10]，从新生软骨基质、细胞分布、表面光滑度、番红O着色情况及番红O着色范围5个方面进行评分，总分19分。由3位专业技术人员双盲条件下实施。

1.4.3 Micro-CT扫描及三维重建 取3组各时间点样本（n=5），用Inveon Micro-CT进行扫描，扫描条件：360°扫描，电压30 kV，电流500 μA，曝光时间3 000 ms。新生软骨下骨三维结构用Mimics13.0软件进行重建，重建精度为41.76 μm。从重建的三维模型中，应用布尔运算选取感兴趣区域的新生软骨下骨部分（图3），得到新生软骨下骨的微结构参数：骨体积分数（bone volume fraction，BV/TV）、骨表面积分数（bone surface area fraction，BSA/BV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁数量（trabecular number，Tb.N）及标识骨小梁之间平均距离的骨小梁分离度（trabecular spacing，Tb.Sp）。1.5 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间及组内各时间点间比较采用单因素方差分析及Tukey post-hoc分析，两两比较采用t检验；采用Pearson相关分析软骨下骨微结构参数与软骨修复（大体评分与组织学评分）之间的相关性。检验水准α=0.05。2 结果

2.1 软骨修复

2.1.1 大体观察 各时间点实验组均未见明显免疫排斥反应及感染等并发症。16周时，实验组大部分缺损区域由白色半透明组织覆盖，新生组织表面与假手术组相比略粗糙，大部分缺损边界清晰；24周时，整个缺损区域均软骨样组织覆盖，新生软骨组织表面较光滑但表面略高，尚有一半缺损边界较明显；52周时，新生软骨组织具有透明软骨特征，呈白色半透明样，表面光滑，缺损边界已不可见。空白对照组24周时缺损区由暗红色纤维样组织填充，表面粗糙，整个缺损区边界明显。见图4。

根据Wayne评分体系，24周时空白对照组评分为

（7.000 0 ± 0.894 4）分，显著低于各时间点实验组及假

手术组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。实验组组内24周及52周评分均显著高于16周，差异有统计学意义（P < 0.05）；24周及52周间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。各时间点实验组评分均低于假手术组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.1.2 组织学观察 假手术组各时间点观察情况一致，具有正常透明软骨特征，表层软骨细胞呈平行排列，中层软骨细胞呈柱状排列，软骨基质红染，潮线结构清晰可见。16周时，实验组修复软骨组织尚不完全，修复组织以透明样和纤维软骨混合而成，细胞排列不规律，可见细胞呈柱状与集簇排列，部分修复组织可见裂隙；24周时，新生软骨组织质量较前明显改善，细胞呈柱状排列且更规律，软骨表面与假手术组正常软骨一样光滑，但未见潮线结构出现；52周时，新生软骨组织情况与24周相同，但潮线结构横贯出现于缺损区域内，表明新生软骨组织开始逐渐恢复软骨正常结构。空白对照组24周时主要由纤维样组织组成，染色着色甚少，未见明显成软骨细胞。见图5。

根据Wayne评分体系，24周时空白对照组评分为（3.666 7 ± 1.154 7）分，显著低于各时间点实验组及假手术组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。实验组组内24周及52周评分均显著高于16周，差异有统计学意义（P < 0.05）；24周及52周间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。各时间点实验组评分均低于假手术组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。2.2 软骨下骨重建

2.2.1 软骨下骨重建及微结构参数变化规律 组织学染色示，术后实验组新生的软骨下骨逐渐从缺损周围向中央迁移，24、52周时迁移的软骨下骨逐渐相互接近，形成与正常软骨下骨类似的骨板结构。实验组修复过程中，新生软骨下骨处于不断改建重建中。BV/TV、BSA/BV、Tb.N在2周时首次出现明显增高，4～8周逐渐恢复至正常软骨下骨水平，16周时再次明显升高，之后恢复至正常水平；2、16周与其余时间点比较差异均有统计学意义（P < 0.05），2、16周间差异无统计学意义（P > 0.05）。Tb.Sp的变化规律与BV/TV、BSA/BV、Tb.N相反，2、16周显著低于其余各时间点，差异有统计学意义（P < 0.05）；2、16周间差异无统计学意义（P > 0.05）。Tb.Th各时间点变化不明显，仅24周时与16周时比较出现升高（P < 0.05），52周时逐渐恢复至正常水平。见表3、图6。

空白对照组术后24周BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N和Tb.Sp分别为10.070 9% ± 2.112 6%、（17.262 0 ± 1.221 0）/mm、（0.116 3 ± 0.008 6）mm、（87.780 6 ± 23.650 2）/mm和（0.012 1 ± 0.003 9） mm。

中国修复重建外科杂志2014年3月第28卷第3期

?321?

12a2b3a3b

4a4c4d5a5b5c缺损模型示意图

5e

植入双相PEG/β-TCP骨

图1 双相PEG/β-TCP骨软骨复合支架外观 图2 兔骨软骨绝对尺寸缺损模型制备及修复

软骨复合支架 图3 新生软骨下骨Micro-CT三维重建

实验组16周

各组组织学观察（番红O/快绿× 1.5）

实验组16周

各时间点各组大体观察

选取新生软骨下骨二维CT中感兴趣区域

新生软骨下骨三维重建 图 4 术后

空白对照组

24周 52

周 图5 术后各时间点实验组

假手术组

24周 实验组24周

假手术组24周

空白对照组24

周 52

Fig.1 Biomimetic biphasic composite scaff

olds appearance Fig.2 Preparation and repair of critical size osteochondral defect models Critical-Osteochondral repairing with biomimetic biphasic composite scaff

old prepared by 3-D printing technique Fig.3 3-D reconstruction of repaired subchondral bone

2-D CT image of new subchondral bone

3-D reconstructive image of new subchondral bone

size osteochondral defect model

Fig.4 Gross observation of each group after operation

operation group at 24 weeks weeks

Experimental group at 16 weeks

Experimental group at 24 weeks

Sham-

Control group at 24 weeks Experimental group at 52 weeks Fig.5 Histological observation of each group after

Experimental group at 16 weeks

Experimental group at 24 weeks

Sham-operation group at 24

operation (Safranin O/fast green × 1.5)

Control group at 24 weeks Experimental group at 52 weeks

假手术组各时间点测量结果一致，以24周为例，分

别为1.818 7% ± 0.186 3%、（7.507 9 ± 1.194 0） /mm、（0.272 6 ± 0.043 2）mm、（6.858 4 ± 1.434 4） /mm和（0.159 3 ± 0.037 1）mm。各时间点实验组及假手术组各指标与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。除实验组2、16周BV/TV、BSA/BV、Tb.N显著高于假手术组，Tb.Sp显著低于假手术组，差异有统计

学意义（P < 0.05）外，其余各时间点及各指标两组间比

较差异均无统计学意义（P > 0.05）。

2.2.2 软骨下骨重建与软骨修复关系 对软骨下骨微结构参数与软骨修复大体及组织学Wayne评分行Pearson相关分析显示：BV/TV、BSA/BV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp与软骨修复大体及组织学评分间均存在相关关系，其中BSA/BV、Tb.Th、Tb.N与大体评分高

笔耕文化传播（http://www.bigengculture.com）包含总结汇报、党团工作、工作范文、IT计算机、人文社科、专业文献、考试资料、资格考试、办公文档以及基于3_D打印技术的软骨修复及软骨下骨重建_张维杰_图文等内容。

本文共2页12

  本文关键词：基于3-D打印技术的软骨修复及软骨下骨重建，由笔耕文化传播整理发布。