多孔钽对人成骨细胞COL-Ⅰ、OC及OPN表达影响的实验研究

发布时间：2017-04-03 05:12

  本文关键词：多孔钽对人成骨细胞COL-Ⅰ、OC及OPN表达影响的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的研究多孔钽支架材料对MG63人成骨细胞增殖、分泌功能以及成骨基因COL-Ⅰ、OC、OPN及蛋白表达影响,探讨多孔钽支架材料作为骨组织工程支架材料来修复骨缺损,恢复骨组织正常生理结构与功能的可行性,为进一步临床应用提供理论与实验依据。方法1扫描电镜观察多孔钽支架材料形态特征。2 MG63人成骨细胞培养及鉴定。分组:以α-MEM完全培养基为浸提介质制备钽浸提液,A组为钽浸提液组(钽浸提液与成骨细胞共培养),B组为钽支架组(钽支架材料与成骨细胞共培养),C组为空白组(单纯成骨细胞培养)。3 CCK-8法分别检测各组成骨细胞的生长增殖状态。4倒置相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察成骨细胞在多孔钽支架上黏附、增殖及超微结构变化。5 ELISA法分别检测多孔钽对成骨细胞分泌COL-Ⅰ与OC功能的影响。6免疫细胞化学染色法检测成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN的蛋白表达并通过图像半定量分析测定光密度(IOD)值。7 Western-blot法检测多孔钽支架对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白表达的影响。8实时荧光定量PCR法检测多孔钽支架对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN m RNA表达的影响。结果1多孔钽支架材料外观为灰色,光洁,表面粗糙,凹凸不平,质硬,材料表面及断面可见均匀分布的蜂窝状、针尖大小的孔隙。扫描电镜下观察,多孔钽具有大量分散微孔结构,孔隙间相互连通,类似人松质骨结构。2 CCK-8结果显示,随着培养时间延长,3组细胞能够良好的贴壁及生长增殖,数量由缓慢到快速增殖,而后稳定生长。经统计学分析得出,3组间细胞增殖比较均无统计学差异(P0.05)。3倒置相差显微镜观察:多孔钽边缘及四周黏附大量成骨细胞,细胞形态正常,呈现多角形及长梭形。扫描电镜显示,随着多孔钽与成骨细胞复合培养时间的延长,成骨细胞数量随之增多,向材料孔隙生长,细胞伸出伪足,分泌的基质逐渐覆盖材料表面及孔隙。透射电镜显示,A组与B组成骨细胞胞浆内具有丰富的粗面内质网、线粒体及高尔基体等细胞超微结构。4成骨细胞COL-Ⅰ及OC分泌功能的检测:第3d时,A、B及C组之间比较OC分泌差异均无统计学意义(P0.05);第5d与7d时,B组OC分泌量高于A、C组(P0.05)。而在不同时间点3组间COL-Ⅰ分泌量均无统计学差异(P0.05)。5免疫细胞化学染色显示:第5d时,3组细胞均有COL-Ⅰ、OC、OPN的表达,胞浆内出现大量棕黄色颗粒,其中B组OC与OPN表达的IOD值高于A、C组(P0.05),而COL-Ⅰ表达的IOD值在3组中差异无统计学意义(P0.05)。6 Western-blot结果显示:第5d时,3组细胞均有COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白的表达,B组OC与OPN表达高于A、C组(P0.05),而3组间COL-Ⅰ蛋白表达差异无统计学意义(P0.05)。7实时荧光定量PCR结果显示:第5d时,A、B组OC、OPN m RNA的表达均高于C组,B组的表达高于A组(P0.05),而3组间COL-Ⅰm RNA表达差异均无统计学意义(P0.05)。结论1多孔钽支架(三维结构)与多孔钽浸提液(二维结构)均有利于人成骨细胞早期生长、黏附及增殖作用。提示:多孔钽具有良好的细胞亲和力和生物相容性。2多孔钽三维空间构型可促使人成骨细胞在材料表面黏附并分泌OC,维持骨形成及骨吸收之间平衡并有利于骨矿化过程;而成骨细胞COL-Ⅰ分泌则不受多孔钽空间构型影响,始终贯穿于成骨全过程,以成骨早期最为显著。3 Western-blot及实时荧光定量PCR检测结果提示:人成骨细胞在多孔钽三维结构培养条件下,成骨基因OC与OPN及相应蛋白的表达均高于二维培养。说明多孔钽-成骨细胞复合物在特定条件下可作为骨移植支架材料修复骨缺损并具有促成骨作用。
【关键词】：多孔钽支架材料 骨组织工程 COL-Ⅰ OC OPN
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R687.3
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-50
• 1.1 材料与方法13-27
• 1.1.1 细胞来源及实验材料13-15
• 1.1.2 扫描电镜观察多孔钽支架材料形态特征15
• 1.1.3 成骨细胞培养及鉴定15-17
• 1.1.4 实验分组17
• 1.1.5 多孔钽－成骨细胞复合物的制备17-18
• 1.1.6 CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测多孔钽材料对成骨细胞增殖的影响18-19
• 1.1.7 扫描电镜观察多孔钽－成骨细胞复合物表面形态19
• 1.1.8 透射电镜观察多孔钽对成骨细胞超微结构的影响19
• 1.1.9 ELISA法检测多孔钽对成骨细胞分泌Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）功能的影响19-20
• 1.1.10 ELISA法检测多孔钽对成骨细胞分泌骨钙素（OC）功能的影响1020-21
• 1.1.11免疫细胞化学染色法检测多孔钽对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白表达的影响21-22
• 1.1.12 Western-blot法检测多孔钽对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白表达的影响22-25
• 1.1.13实时荧光定量PCR法检测多孔钽对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN mRNA表达的影响25-27
• 1.2 结果27-41
• 1.2.1 多孔钽材料的物理特性27-28
• 1.2.2 倒置相差显微镜下观察MG63人成骨细胞形态特征28-30
• 1.2.3 CCK-8 法检测多孔钽对成骨细胞增殖的影响30-32
• 1.2.4 扫描电镜观察多孔钽－成骨细胞复合物表面形态32
• 1.2.5 透射电镜观察多孔钽对成骨细胞超微结构的影响32-33
• 1.2.6 ELISA法检测多孔钽对成骨细胞Ⅰ型胶原 (COL-Ⅰ )与骨钙素（OC）分泌功能的影响33-35
• 1.2.7 免疫细胞化学染色检测多孔钽对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN蛋白表达的影响35-37
• 1.2.8 Western-blot检测多孔钽对成骨细胞COL-Ⅰ、OC和OPN蛋白表达的影响37-38
• 1.2.9 实时荧光定量PCR法检测多孔钽对成骨基因COL-Ⅰ、OC和OPN mRNA表达的影响38-41
• 1.3 讨论41-46
• 1.3.1 多孔钽 3D空间结构为成骨细胞的黏附及生长提供良好的环境41-42
• 1.3.2 多孔钽与成骨细胞复合培养有利于细胞增殖42-43
• 1.3.3 多孔钽三维结构对成骨细胞分泌功能及矿化有促进作用43-45
• 1.3.4 多孔钽对成骨细胞COL-Ⅰ、OC、OPN基因及蛋白表达增强45-46
• 1.4 小结46-47
• 参考文献47-50
• 第2章 综述 多孔钽的生物学特性与关节重建50-56
• 2.1 钽的生物学特性50-51
• 2.2 钽在人工关节置换术中的应用51-52
• 2.3 展望52-53
• 参考文献53-56
• 结论56-57
• 附录 医疗器械生物学评价57-59
• 致谢59-60
• 导师简介60-61
• 作者简介61-62
• 学位论文数据集62

【参考文献】

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1 刘刚,胡蕴玉,颜永年,熊卓,王哲,吕荣,白建萍,杨家骥;Ⅰ型胶原修饰的多孔材料聚乙醇酸-乳酸共聚物对兔骨髓间充质干细胞粘附和增殖及成骨细胞基因表达的影响[J];中华医学杂志;2003年07期

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本文编号：283769