瘦素对兔膝关节软骨损伤修复的作用

发布时间：2017-04-06 09:11

  本文关键词：瘦素对兔膝关节软骨损伤修复的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的通过软骨细胞海藻酸钙支架共培养,观察软骨细胞在支架材料上的生物行为。将支架植入兔膝关节软骨缺损模型,定期膝关节局部注射10ng/ml的瘦素,观察、缺损处的修复状况,进而探讨瘦素对兔膝关节软骨损伤是否具有一定的修复作用。方法1.软骨细胞分离与培养:2只健康4周龄新西兰兔膝关节软骨,将软骨细胞分离及扩增、传代。光镜下软骨细胞呈星形、多角形,铺路石样生长,HE染色观察软骨细胞形态,免疫组化染色观察Ⅱ型胶原分泌情况。2.海藻酸钠与氯化钙混合后得到的三维支架,将传代的软骨细胞培养于其中。显微镜下观察细胞生长增殖状况,并做HE染色及免疫组化染色。3.用成年新西兰大白兔制备兔膝关节缺损模型。4.将实验动物随机分为3组:对照组:每5日经兔膝关节腔内注射1ml生理氯化钠;支架组:经兔膝关节缺损腔内植入修整好的含有软骨细胞的三维支架,并每5日注射生理氯化钠1ml;实验组:三维支架植入后,每5日局部注射1ml的10ng/ml瘦素。实验中注意随机分组,实验个体缺损部位相同,分别于术后12周处死取材,观察缺损区软骨生长修复情况,并用HE染色、Masson染色、免疫组化染色及PCR定量分析检验修复情况。以评价瘦素对三维支架植入对软骨缺损的修复作用。结果1.分离下来的软骨细胞呈圆形或椭圆形,经24小时后逐渐贴壁,72小时后大部分已经贴壁。2.传代后的软骨细胞HE染色镜下观察呈三角形、多角形或梭形,细胞核明显,呈圆形或椭圆形,HE染色显示软骨细胞形态良好。免疫组化染色观察结果见细胞及基质呈棕黄色,细胞密集处颜色较深,表现出其特有活性。3.将混悬的软骨细胞、海藻酸钠、氯化钙混合,制备出了三维支架,支架内培养的细胞未见明显的凋亡与裂解,且细胞活性良好,HE及免疫组化检查结果说明三维培养的细胞适合植入。4.植入关节腔内后,未见明显炎症反应及免疫排斥反应,支架软硬适宜,不会损伤关节软骨,且后期材料降解完全,无关节残留,表现出良好的组织相容性。5.植入修整后的三维支架并每日注射瘦素,促进了Ⅱ型胶原及IGF-1的生成,对缺损处的修复有明显促进作用。6.实验组:膝关节缺损处表面平整较光滑,与其他两组相比,PCR扩增实验检测IGF-1分泌明显高于其他两组,差异具有统计学意义;对照组:缺损处未见明显修复,膝关节粘连、关节软骨破坏较重,可见明显骨性关节炎表现;支架组:缺损处软骨较光滑,但低于实验组,膝关节未见骨性关节炎表现。7.组织病理学检查显示,实验组纤维及瘢痕组织较少,Ⅱ型胶原染色显示数量高于其他两组,HE染色显示少量成纤维细胞,核较小,排列相对规则。对照组纤维组织多,排列紊乱,软骨细胞少,核大,排列不规律。支架组软骨细胞细胞核、成纤维细胞数量及结构介于两者之间。结论1.藻酸钙支架与软骨细胞共培养,软骨细胞可以很好的在支架材料的表面和内部黏附、生长及增殖,细胞活性良好,未见明显细胞毒性。2.实验过程中藻酸钙支架材料在兔体内引起的炎症反应轻微,血管化良好,材料降解吸收缓慢,具有良好的组织相容性。3.本实验条件下10ng/ml的瘦素,可促进软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原及IGF-1的分泌,局部定期注射可促进兔膝关节软骨损伤的修复。
【关键词】：瘦素 藻酸钙支架 软骨细胞 修复 Ⅱ型胶原 IGF-1
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R687;R318.08
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 软骨细胞的获取与平面培养13-23
• 1.1 前言13
• 1.2 材料与方法13-16
• 1.2.1 主要仪器和实验试剂13-15
• 1.2.2 实验步骤15
• 1.2.3 软骨细胞HE染色检查步骤15-16
• 1.2.4 免疫组化染色步骤16
• 1.3 结果16-18
• 1.3.1 平面培养下软骨细胞的形态观察16-17
• 1.3.2 软骨细胞的HE染色检查结果17-18
• 1.3.3 平面培养软骨细胞的Ⅱ型胶原免疫组化染色检查结果18
• 1.4 讨论18-20
• 1.4.1 关节软骨的结构18-19
• 1.4.2 软骨细胞和基质的作用及其影响因素19-20
• 1.4.3 软骨细胞移植的可行性20
• 1.5 本章小结20-21
• 参考文献21-23
• 第2章 藻酸钙支架的制备及细胞共培养23-29
• 2.1 前言23
• 2.2 材料与方法23-25
• 2.2.1 仪器和实验试剂23-24
• 2.2.2 藻酸钙支架的制备24-25
• 2.2.3 支架HE染色步骤25
• 2.2.4 支架免疫组织化学染色25
• 2.3 结果25-27
• 2.3.1 藻酸钙支架稳定性观察25-26
• 2.3.2 三维培养软骨细胞的HE染色检查结果26-27
• 2.3.3 支架的免疫组织化学染色检查结果27
• 2.4 讨论27-28
• 2.4.1 海藻酸盐的应用及其支架内的细胞培养27-28
• 2.5 本章小结28
• 参考文献28-29
• 第3章 藻酸钙支架植入及瘦素对软骨损伤修复的作用29-43
• 3.1 前言29
• 3.2 材料与方法29-35
• 3.2.1 主要仪器和实验试剂29-30
• 3.2.2 兔膝关节软骨缺损模型的制备30-31
• 3.2.3 软骨组织的HE染色31-32
• 3.2.4 Masson染色32
• 3.2.5 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色32
• 3.2.6 多聚酶链式反应（PCR）法测定IGF-1 基因表达32-34
• 3.2.7 瘦素对兔软骨损伤修复实验流程图34-35
• 3.3 结果35-38
• 3.3.1 膝关节缺损模型修复状况的大体观察35
• 3.3.2 软骨缺损处HE染色检查结果35-36
• 3.3.3 软骨缺损处Masson染色检查结果36-37
• 3.3.4 软骨缺损处Ⅱ型胶原免疫组化染色结果37
• 3.3.5 RT-PCR法检测IGF-1 基因表达结果37-38
• 3.4 讨论38-41
• 3.4.1 影响瘦素修复的关节软骨自身因素38-39
• 3.4.2 瘦素对支架材料修复作用的影响39-40
• 3.4.3 瘦素对IGF-1 的作用及对修复的影响40-41
• 3.5 本章小结41
• 参考文献41-43
• 第4章 综述43-55
• 4.1 课题的背景和意义43-44
• 4.2 组织工程学与支架材料44-45
• 4.3 关节软骨和软骨下损伤的自我修复45-46
• 4.4 瘦素对骨及软骨的作用46-51
• 4.4.1 瘦素受体46
• 4.4.2 瘦素对骨的影响46-48
• 4.4.3 瘦素对软骨的影响48-51
• 参考文献51-55
• 结论55-56
• 致谢56-57
• 导师简介57-58
• 作者简介58-59
• 学位论文数据集59

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本文编号：288623