载锶相转变溶菌酶涂层修饰的钛表面促进骨生成及骨免疫调节的研究

发布时间：2020-11-16 13:52

　　 目的:钛(titanium,Ti)及其合金已成为牙列缺损及牙列缺失修复过程中广泛使用的骨内植入材料,但是由于缺乏生物活性和骨诱导性,钛种植体植入机体后至少需要3-6个月才能实现骨整合。因此提高种植体表面生物活性、加快骨结合进程已成为目前种植体表面改性的研究热点,而钛表面掺锶(strontium,Sr)改性是有效手段之一。然而传统的物理、化学等掺锶改性方法操作步骤复杂、反应条件苛刻、制备成本较高,所以需要寻求一种绿色简单、经济高效的掺锶改性策略。相转变溶菌酶(phase-transited lysozyme,PTL)是一种新型的类淀粉样材料,利用溶菌酶的相转变过程可以构建多种基材的表面功能化涂层。本研究利用PTL一步法制备载锶涂层,并探究其对骨生成及骨免疫调节的影响。方法:1.在钛表面构建不同载锶量的相转变溶菌酶涂层作为实验组,包括PTL、PTL@10Sr、PTL@20Sr、PTL@50Sr组;以抛光处理的空白钛片(Ti)作对照组。对这五组钛样品进行表面表征及缓释实验,使用场发射扫描电镜(FE-SEM)观察各组样品的表面形貌特征;X射线光电子能谱(XPS)剖析各组样品的元素组成及比例;电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)分析各组样品的离子释放情况。2.各组钛样品进行表征分析后,在其表面培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并检测其粘附、伸展、增殖、迁移与成骨分化等情况。MTS实验以及激光共聚焦显微镜(CLSM)用于观察各组钛表面细胞的早期黏附和伸展情况;通过MTS实验分析细胞增殖情况;利用Transwell小室系统检测各组钛表面对细胞迁移的影响;各组钛表面上细胞成骨诱导后通过碱性磷酸酶试剂盒(ALP-Kit)检测的其ALP活性、逆转录PCR测定成骨转录因子Runx2及骨钙素Ocn的基因表达水平、蛋白质印迹法和免疫荧光检测RUNX2的蛋白表达水平。3.在各组钛样品表面培养巨噬细胞RAW264.7,通过逆转录PCR检测相关基因(如肿瘤坏死因子Tnfα、白细胞介素Il6、白细胞介素Il10、骨形态发生蛋白Bmp2、转化生长因子Tgfβ1)的mRNA水平,评估巨噬细胞对不同钛表面的响应情况。建立巨噬细胞和BMSCs的共培养模型,利用Transwell小室系统、ALP-Kit和逆转录PCR试验评估巨噬细胞条件培养基对BMSCs迁移以及成骨分化的影响。4.通过体内实验建立股骨植入模型,通过组织学分析检测特定时间内不同植入物周围的炎症情况及骨生成程度,进一步验证各组钛样品对骨生成的影响。结果:1.利用相转变溶菌酶技术在钛表面成功制备出不同载锶量的PTL涂层。FE-SEM结果显示PTL涂层呈类淀粉样项链状纤维网络结构,均匀分布于钛片表面。XPS结果表明PTL涂层以及载锶PTL涂层都成功定植于钛片表面。缓释实验表明载锶PTL涂层能够持续稳定地释放锶离子。2.钛表面培养BMSCs的增殖实验结果表明,BMSCs在各组钛表面均具有良好的活性,PTL涂层及锶对细胞的增殖几乎无影响;MTS和CLSM结果表明,PTL涂层及载锶PTL涂层有利于BMSCs的早期黏附和伸展;载锶PTL组,尤其是PTL@20Sr组表现出更强的促进细胞迁移的能力;同时多项实验结果显示载锶PTL组,尤其是PTL@20Sr组更有利于BMSCs的成骨分化。3.逆转录PCR实验结果表明,与空白对照组相比,PTL@20Sr组更能降低巨噬细胞相关炎症因子Tnfα、Il6的mRNA水平,同时促进成骨相关基因Bmp2、Tgfβ1的表达;而且PTL@20Sr组的巨噬细胞条件培养基更有利于BMSCs的迁移及成骨分化。4.体内实验结果表明,植入初期,PTL和PTL@20Sr组植入物周围有较少的炎细胞浸润;植入1个月后,PTL@20Sr组能够观察到更多的新骨生成。结论:本研究利用相转变溶菌酶技术成功地将锶修饰于钛表面。体内、体外实验结果证明与对照组空白钛表面相比,载锶PTL涂层可以促进BMSCs细胞粘附、伸展和迁移,促进成骨分化;同时还可作用于巨噬细胞,影响免疫微环境,更好地诱导BMSCs成骨分化。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R783.1
【部分图文】：

PTL 组可见均匀覆盖在光滑钛表面的相转变溶菌酶涂层，呈类淀粉样链状纤维网状结构；高倍镜图像（图1.1E）显示构成 PTL 涂层的球形颗粒直径约为 500nm。图 1.1C 和图 1.1F 为PTL@Sr 组的表面形貌观察结果，其与 PTL 组基本相似。图 1.1 各组钛试样表面 FE-SEM 观察结果图 (A、D) Ti 组, (B、E) PTL 组, (C、F) PTL@Sr 组1.2.2 各组钛表面 X 射线光电子能谱分析图 1.2 为 X 射线光电子能谱的分析结果，分别显示了 Ti 组、PTL 组以及PTL@Sr 组的表面化学组成。所有的结合能均以 C1s 谱峰（284.8 eV）作为内部参考进行校准。如图 1.2A 所示，Ti 组的扫描光谱具有 C1s、Ti2p3（458eV）、O1s（530eV）和 N1s（399eV）谱峰，说明对照组空白钛片主要元素成分包括 Ti、C、O 和 N。C1s 信号可能是由于环境中的污染所导致的波谱[45]。PTL 组（图1.2B）中来自 TCEP 和溶菌酶的 P2p（132 eV）和 S2p（164 eV）特征峰的出现以及 Ti2p3 波峰的减弱表明 PTL 涂层已成功地将钛基材覆盖。这与 XPS 定量分析的数据结果一致（表 1.1）。图 1.2C 中可见结合能为 270eV 的 Sr3p3 特征峰，这表明锶离子已成功地沉积在 PTL 改性层中。

C1s 信号可能是由于环境中的污染所导致的波谱[45]。PTL 组（图1.2B）中来自 TCEP 和溶菌酶的 P2p（132 eV）和 S2p（164 eV）特征峰的出现以及 Ti2p3 波峰的减弱表明 PTL 涂层已成功地将钛基材覆盖。这与 XPS 定量分析的数据结果一致（表 1.1）。图 1.2C 中可见结合能为 270eV 的 Sr3p3 特征峰，这表明锶离子已成功地沉积在 PTL 改性层中。

表 1.1 各组钛试样表面元素组成的 XPS 检测分析1.2.3 各组钛片锶离子释放情况图1.3显示了28d内钛表面不同载锶涂层的释放动力学。锶离子在PTL@10Sr、PTL@20Sr、PTL@50Sr 组中显示出类似的减少趋势。缓释实验进行的第一天所有试样均有突释现象出现，三天后逐渐进入平稳释放期，这一时期 PTL@10Sr、PTL@20Sr 和 PTL@50Sr 组中锶的平均日释放量分别为 0.181μg/mL 、0.288μg/mL 和 0.572μg/mL。而且在同一检测时间，各组涂层释放的锶离子量遵循以下规律 PTL@50Sr 组>PTL@20Sr 组> PTL@10Sr 组。C% N% O% Ti% P% S% Sr%Ti61.47±0.234.64±0.0926.94±0.126.95±0.300 0 0PTL64.40±0.2116.28±0.0618.34±0.2000.16±0.050.83±0.070PTL@Sr58.69±0.3716.87±0
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本文编号：2886305