基于新型纳米复合物的阿尔兹海默症Tau蛋白靶向诊治一体化实验研究

发布时间：2020-11-18 14:59

　　 阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的起病隐匿、进行性发展的神经系统退行性疾病。AD患者主要临床表现为学习记忆和日常生活能力受损。2018年世界阿尔兹海默症报告显示,目前世界上约有5000万AD患者,预计到2050年,患者总数将达1.52亿人,给家庭和社会带来沉重负担。AD特征性神经病理改变包括β淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)沉积形成老年斑和Tau蛋白过度磷酸化所致神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。目前靶向Aβ的多项临床试验无法延缓或阻止疾病进展,而Tau蛋白高度磷酸化聚集形成的NFTs与认知功能改变密切相关,有可能成为AD潜在的治疗靶点。18F-AV-1451 PET分子影像可以无创、动态、灵敏地反映活体组织Tau蛋白病理生理变化过程、监测疾病进展,为Tau蛋白靶向疗法提供准确量化的影像学证据。近年来,无机纳米材料因其具有较好的稳定性和成像、抗氧化及药物递送等性能而成为生物医学领域的研究热点,被应用于多种动物疾病模型,特别是神经系统退行性疾病的诊断和治疗研究中。然而,关于无机纳米材料在AD靶向治疗及诊治一体化上的研究却少有报道。因此我们提出,将无机纳米材料与抗双螺旋纤维 tau(paired helical filament-tau,PHF-tau)单克隆抗体结合,构建靶向Tau 蛋白的新型纳米复合物,可以改善AD模型大鼠的认知功能,延缓AD的病理进展。同时,利用18F-AV-1451 PET分子影像进行AD活体精确诊断和纳米复合物疗效评估,为AD精准诊治提供新的思路和方法。本研究创新性地在磁性介孔硅纳米粒子(magnetic mesoporous silica nanoparticles,MMSN)与氧化铈纳米粒子(cerium oxide nanoparticles,CeONP)构成的非靶向纳米复合物(untargeted nanocomposites,UTNC)表面共价偶联抗PHF-tau单克隆抗体AT8,得到AT8修饰的靶向纳米复合物(targeted nanocomposites modified with AT8,TNC-AT8)。通过透射电镜和X线能谱分析对TNC-AT8的形貌和组成进行表征,发现TNC-AT8是一种粒径小的单分散球形纳米颗粒,具有氧、硅、铁、铈等各元素的特征性吸收峰;SDS-PAGE凝胶电泳证实了 AT8抗体成功高效地连接至纳米复合物表面;MRI测试发现TNC-AT8具有良好的T2造影性能;细胞毒性实验表明,TNC-AT8对SH-SY5Y神经元样细胞毒性低,生物相容性良好。为进一步探讨新型纳米复合物TNC-AT8用于AD诊治一体化的可能性,我们在细胞和动物水平上进行了以下实验:在细胞水平,免疫荧光及蛋白印迹结果表明,TNC-AT8作用于冈田酸(okadaic acid,OA)诱导的AD细胞模型后,引起自噬相关蛋白LC3B和LAMP 1表达增高,通过诱导自噬机制清除胞内磷酸化Tau蛋白(phosphorylated tau,p-tau)、促进p62蛋白在溶酶体中发生降解,从而显著降低胞内p-tau水平;透射电镜观察到胞内存在大量自噬小体结构;活细胞荧光成像结果显示,TNC-AT8还能通过清除线粒体活性氧,缓解氧化应激损伤。在动物水平,通过侧脑室注射TNC-AT8评价其对OA诱导的AD大鼠模型的诊治效果。18F-AV-1451 microPET/CT活体显像发现,TNC-AT8可选择性靶向并显著清除AD大鼠病灶海马区的PHF-tau;Morris水迷宫结果表明,TNC-AT8能明显改善AD大鼠的空间学习和记忆能力;免疫组织化学染色结果提示,TNC-AT8能抑制AD病灶海马炎性胶质增生、保护神经元;活体MRI及离体ICP-MS发现,TNC-AT8可靶向并滞留于病灶海马,用做AD大鼠的脑部MR成像。因此,TNC-AT8不仅可以靶向Tau蛋白治疗AD,还能在体可视化病灶海马,从而实现AD诊治一体化。综上所述,本研究开发的靶向Tau蛋白的新型纳米复合物TNC-AT8具有良好的生物相容性,在细胞水平能通过诱导自噬有效清除毒性PHF-tau。18F-AV-1451 PET分子影像可用于时空动态评估TNC-AT8在大鼠脑内实现AD诊治一体化。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R749.16;R318.08
【部分图文】：

位论文?正文状位图像上勾选感兴趣脑区（Ｒｅｇｉｏｎ?ｏｆ?ｉｎｔｅｒｅｓｔ，?ＲＯＩ），本实海马和小脑（小脑几乎不摄取１８Ｆ－ＡＶ－１４５１，故设为为参照脑数据并进行数据分析，数值表示为海马与小脑标准摄ｐｔａｋｅ?ｖａｌｕｅ?ｒａｔｉｏ，?ＳＵＶＲ）〇??

?０＾?ＣｅＯＮＰ?ＮＨ２－ＰＥＧ－ＣＯＯＨ?一表?ＡＴ８??图３．１ＴＮＣ－ＡＴ８纳米抗体复合物合成示意图。磁性介孔硅纳米粒子（ＭＭＳＮ）与氧化铈纳米??粒子（ＣｅＯＮＰ）组装得到非靶向纳米复合物（ＵＴＮＣ），在ＵＴＮＣ表面修饰靶向ＰＨＦ－ｔａｕ的??ＡＴ８抗体得到靶向纳米复合物（ＴＮＣ－ＡＴ８）。??ＭＭＳＮ?ＣｅＯＮＰ?ＴＮＣ－ＡＴ８??ｆｔ?？?＊?■?＂？ＶＩ＃?秦??图３．２磁性介孔硅纳米粒子（ＭＭＳＮ）、氧化铈纳米粒子（ＣｅＯＮＰ）和由它们构成的并在表??面修饰ＡＴ８抗体的靶向纳米复合物（ＴＮＣ－ＡＴ８）的ＴＥＭ图。??３０??

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本文编号：2888847