Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞前后生物学特性的研究
发布时间：2021-01-26 19:50
目的对Ad-BMP-2/GFP转染兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）前后的生物学特性进行观察。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离获取第10代兔BMSCs,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD45、CD29的表达,用携带BMP2和GFP基因的腺病毒转染细胞。分别通过倒置荧光显微镜下观察转染前后细胞形态改变,MTT法分析转染前后细胞增殖的情况,体外Ⅰ型胶原免疫组化染色和钙结节茜素红染色以观察转染前后细胞的成骨分化情况,Western Blot检测转染前后细胞内目的蛋白表达。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能获取高纯度第10代兔BMSCs,流式细胞仪检测显示CD44、CD29阳性,CD45阴性。Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,细胞形态向成骨方向分化,在短时间内能促进兔BMSCs的增殖（P<0.05）,Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阳性,Western Blot显示细胞内稳定表达BMP-2目的蛋白。结论 Ad-BMP-2/GFP能成功转染兔骨髓间充质干细胞并能改变其生物学特性。
【文章来源】：中国骨质疏松杂志. 2014,20(12)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
第10代兔BMSCs表面标志物表达情况(CD29、CD44、CD45的阳性细胞分别占61.8%、93.6%、0.3%)
图2兔BMSCs转染后14天荧光显微镜下细胞形态(×200)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组Fig．2CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor14daysunderthefluorescencemicroscope(×200)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．图3兔BMSCs转染后21天倒置显微镜下细胞形态(×100)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组;Ad-BMP-2/GFP组见不透光的矿化结节;Ad-GFP组细胞发生接触性抑制，生长速度减慢Fig．3CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor21daysundertheinvertedmicroscope(×100)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．Ad-BMP-2/GFPgroupshowedopaquemineralizednodules;Ad-GFPgroupshowedcell-contactinhibitionandslowcellgrowth．象，而对照组细胞增殖旺盛，传代较快，可见BMSCs成骨分化后，较未分化的BMSCs增殖速度减慢。图4MTT检测转染前后细胞增值动力学改变(*P＜0.05)Fig．4CellproliferationwasanalyzedusingMTTaftertransfection(*P＜0.05)2.4转染前后细胞成骨能力改变Ad-BMP-2/GFP组第14d细胞爬片，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性表达，细胞胞浆出现棕黄色颗粒，大小形态均一，见图5，第21d细胞爬片茜素红染色后为红色，见图6。而未转染组和Ad-GFP组Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阴性。2.5转染前后细胞目的蛋白表达检测WesternBlot法检测目的基因蛋白表达，化学发光法采图见图7，结果显示Ad-BMP-2/GFP组检测到约Mr30kD大小的阳性条带，而Ad-GFP组及未转染组可见较弱条带。说明Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs后细胞在蛋白水平有高表达。3讨论骨髓间充质干细胞(BMSCs)已经成为骨组织工程主要的种子细胞来源，由于其来源丰富，易于在体外分离培养，并具有自我更新和多系分化的能力，逐渐成为基因治疗靶细胞
图2兔BMSCs转染后14天荧光显微镜下细胞形态(×200)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组Fig．2CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor14daysunderthefluorescencemicroscope(×200)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．图3兔BMSCs转染后21天倒置显微镜下细胞形态(×100)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组;Ad-BMP-2/GFP组见不透光的矿化结节;Ad-GFP组细胞发生接触性抑制，生长速度减慢Fig．3CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor21daysundertheinvertedmicroscope(×100)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．Ad-BMP-2/GFPgroupshowedopaquemineralizednodules;Ad-GFPgroupshowedcell-contactinhibitionandslowcellgrowth．象，而对照组细胞增殖旺盛，传代较快，可见BMSCs成骨分化后，较未分化的BMSCs增殖速度减慢。图4MTT检测转染前后细胞增值动力学改变(*P＜0.05)Fig．4CellproliferationwasanalyzedusingMTTaftertransfection(*P＜0.05)2.4转染前后细胞成骨能力改变Ad-BMP-2/GFP组第14d细胞爬片，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性表达，细胞胞浆出现棕黄色颗粒，大小形态均一，见图5，第21d细胞爬片茜素红染色后为红色，见图6。而未转染组和Ad-GFP组Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阴性。2.5转染前后细胞目的蛋白表达检测WesternBlot法检测目的基因蛋白表达，化学发光法采图见图7，结果显示Ad-BMP-2/GFP组检测到约Mr30kD大小的阳性条带，而Ad-GFP组及未转染组可见较弱条带。说明Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs后细胞在蛋白水平有高表达。3讨论骨髓间充质干细胞(BMSCs)已经成为骨组织工程主要的种子细胞来源，由于其来源丰富，易于在体外分离培养，并具有自我更新和多系分化的能力，逐渐成为基因治疗靶细胞
【参考文献】：
期刊论文
[1]转基因技术及骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用与展望[J]. 陈佳滨,武成聪,李强,茹嘉,宁寅宽,蔡伟良. 临床医学工程. 2013(11)
[2]骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用[J]. 林昭伟,李奇. 中国组织工程研究. 2012(49)
[3]骨组织工程中的检测方法及其效果评估展望[J]. 程谷,李祖兵. 国际口腔医学杂志. 2010(05)
[4]密度梯度离心与贴壁法相结合体外分离培养兔骨髓基质干细胞:1～3代细胞生长特性[J]. 潘华,王大伟,李红波,张志伟. 中国组织工程研究与临床康复. 2007(42)
本文编号：3001718
【文章来源】：中国骨质疏松杂志. 2014,20(12)北大核心
【文章页数】：6 页
【部分图文】：
第10代兔BMSCs表面标志物表达情况(CD29、CD44、CD45的阳性细胞分别占61.8%、93.6%、0.3%)
图2兔BMSCs转染后14天荧光显微镜下细胞形态(×200)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组Fig．2CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor14daysunderthefluorescencemicroscope(×200)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．图3兔BMSCs转染后21天倒置显微镜下细胞形态(×100)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组;Ad-BMP-2/GFP组见不透光的矿化结节;Ad-GFP组细胞发生接触性抑制，生长速度减慢Fig．3CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor21daysundertheinvertedmicroscope(×100)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．Ad-BMP-2/GFPgroupshowedopaquemineralizednodules;Ad-GFPgroupshowedcell-contactinhibitionandslowcellgrowth．象，而对照组细胞增殖旺盛，传代较快，可见BMSCs成骨分化后，较未分化的BMSCs增殖速度减慢。图4MTT检测转染前后细胞增值动力学改变(*P＜0.05)Fig．4CellproliferationwasanalyzedusingMTTaftertransfection(*P＜0.05)2.4转染前后细胞成骨能力改变Ad-BMP-2/GFP组第14d细胞爬片，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性表达，细胞胞浆出现棕黄色颗粒，大小形态均一，见图5，第21d细胞爬片茜素红染色后为红色，见图6。而未转染组和Ad-GFP组Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阴性。2.5转染前后细胞目的蛋白表达检测WesternBlot法检测目的基因蛋白表达，化学发光法采图见图7，结果显示Ad-BMP-2/GFP组检测到约Mr30kD大小的阳性条带，而Ad-GFP组及未转染组可见较弱条带。说明Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs后细胞在蛋白水平有高表达。3讨论骨髓间充质干细胞(BMSCs)已经成为骨组织工程主要的种子细胞来源，由于其来源丰富，易于在体外分离培养，并具有自我更新和多系分化的能力，逐渐成为基因治疗靶细胞
图2兔BMSCs转染后14天荧光显微镜下细胞形态(×200)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组Fig．2CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor14daysunderthefluorescencemicroscope(×200)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．图3兔BMSCs转染后21天倒置显微镜下细胞形态(×100)。A:Ad-BMP-2/GFP组;B:Ad-GFP组;Ad-BMP-2/GFP组见不透光的矿化结节;Ad-GFP组细胞发生接触性抑制，生长速度减慢Fig．3CellmorphologyofAd-BMP-2/GFPtransfectedBMSCsfor21daysundertheinvertedmicroscope(×100)．A:Ad-BMP-2/GFPgroup;B:Ad-GFPgroup．Ad-BMP-2/GFPgroupshowedopaquemineralizednodules;Ad-GFPgroupshowedcell-contactinhibitionandslowcellgrowth．象，而对照组细胞增殖旺盛，传代较快，可见BMSCs成骨分化后，较未分化的BMSCs增殖速度减慢。图4MTT检测转染前后细胞增值动力学改变(*P＜0.05)Fig．4CellproliferationwasanalyzedusingMTTaftertransfection(*P＜0.05)2.4转染前后细胞成骨能力改变Ad-BMP-2/GFP组第14d细胞爬片，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性表达，细胞胞浆出现棕黄色颗粒，大小形态均一，见图5，第21d细胞爬片茜素红染色后为红色，见图6。而未转染组和Ad-GFP组Ⅰ型胶原免疫组化染色、茜素红染色均呈阴性。2.5转染前后细胞目的蛋白表达检测WesternBlot法检测目的基因蛋白表达，化学发光法采图见图7，结果显示Ad-BMP-2/GFP组检测到约Mr30kD大小的阳性条带，而Ad-GFP组及未转染组可见较弱条带。说明Ad-BMP-2/GFP转染兔BMSCs后细胞在蛋白水平有高表达。3讨论骨髓间充质干细胞(BMSCs)已经成为骨组织工程主要的种子细胞来源，由于其来源丰富，易于在体外分离培养，并具有自我更新和多系分化的能力，逐渐成为基因治疗靶细胞
【参考文献】：
期刊论文
[1]转基因技术及骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用与展望[J]. 陈佳滨,武成聪,李强,茹嘉,宁寅宽,蔡伟良. 临床医学工程. 2013(11)
[2]骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的应用[J]. 林昭伟,李奇. 中国组织工程研究. 2012(49)
[3]骨组织工程中的检测方法及其效果评估展望[J]. 程谷,李祖兵. 国际口腔医学杂志. 2010(05)
[4]密度梯度离心与贴壁法相结合体外分离培养兔骨髓基质干细胞:1～3代细胞生长特性[J]. 潘华,王大伟,李红波,张志伟. 中国组织工程研究与临床康复. 2007(42)
本文编号：3001718
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