同种异体脂肪源性间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究

发布时间：2017-04-12 12:57

  本文关键词：同种异体脂肪源性间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分兔脂肪源性间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定以及多向诱导分化研究目的：建立体外分离培养获得兔脂肪源性间充质干细胞(rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells, rADSCs)的方法,并对其形态学、生物学特性进行观察并对其表面标志物进行鉴定；将分离培养的rADSCs体外诱导,使其向成骨、成脂方向分化,观察其多向细胞分化的潜能。方法：切取兔颈背区皮下脂肪,用0.1%I型胶原酶消化法获得兔脂肪源性间充质干细胞,进行体外培养,用胰蛋白酶消化法传代扩增。用CCK-8法细胞增殖实验绘制细胞增殖曲线。应用流式细胞术检测细胞表面标志物。第4代rADSCs经成脂诱导后,用油红0染色,成骨诱导后,分别用茜素红染色、碱性磷酸酶染色,观察其成骨、成脂分化潜能。结果：rADSCs细胞呈长梭形漩涡样贴壁生长,增殖能力强。将第4代rADSCs用分子流式细胞仪检测,可见CD29、CD90、CD44阳性率高,而CD34和CD45阳性率低。第4代rADSCs在诱导剂的诱导下分化为脂肪细胞和成骨细胞,成脂诱导后的rADSCs经油红0染色呈阳性结果,成骨诱导后的rADSCs经碱性磷酸酶和茜素红染色均呈阳性结果。结论：来源于兔颈背区的皮下脂肪组织取材相对容易且可供取材的组织量大,脂肪组织内细胞量充足,可简单进行体外分离培养；兔脂肪源性间充质干细胞(rADSCs)在体外增殖速度快,能够保持稳定的传代,直至第10代；ADSCs具有分化成骨细胞、成脂细胞等多向细胞分化的潜能,是组织工程骨理想的种子细胞。第二部分兔脂肪源性间充质干细胞在β-磷酸三钙支架上体外共培养,构建rADSCs/ β-TCP骨组织工程复合体及体外成骨分化的研究目的： 将β-磷酸三钙(β-Tricalcium phosphate,β-TCP)支架与经传代分离获取的兔脂肪源性间充质干细胞在体外共培养,构建成rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体,观察在组织工程支架上rADSCs向成骨细胞分化的能力。方法：将体外分离培养的rADSCs接种于β-TCP支架上,从在β-TCP支架上加入细胞悬液开始计时,在细胞培养的第24h开始,每24h至第7d进行CCK-8检测细胞在材料中的增殖情况,培养7d后用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)测定试剂盒检测细胞在材料内表达ALP的情况,以rADSCs直接接种于12孔板培养贴壁生长作为对照组,在相同时间点进行细胞增殖以及ALP活性的检测,结果进行统计学分析。将rADSCs细胞悬液接种于β-TCP支架上,在体外共培养3d和7d,在扫描电镜下观察其生长情况。结果：经CCK-8法检测,细胞在支架材料上增殖的结果示：各组的吸光度都随时间延长而逐渐升高,与β-TCP支架共培养7d的细胞与对照组相比较,第2天、第5天细胞与支架材料共培养组和对照组间差异有统计学意义,在支架材料上的细胞增殖能力较强,其余时间点的两组间差异均无统计学意义；并且随着时间的延长,细胞的增殖不受影响并具有良好的生物学活性。ALP活性测定结果表明,接种的rADSCs细胞在β-TCP支架上生长良好,具有较高的ALP活性,与对照相比,差异有统计学意义,β-TCP具有一定的促进细胞成骨作用。扫描电镜观察细胞与材料接触紧密,细胞呈长梭形伸展,分布均匀。结论：β-TCP支架具有良好的生物相容性,rADSCs在支架上共培养时支架材料不具有细胞毒性;rADSCs在β-TCP支架上共培养后,细胞的增殖能力无明显减弱,并且仍具有向成骨分化的能力。第三部分应用rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究目的：以β-TCP陶瓷为支架材料,复合兔脂肪源性间充质干细胞,探讨构建组织工程骨修复骨缺损的可行性。方法：体外培养的兔脂肪源性间充质干细胞(rADSCs)接种于β-TCP支架上,构建rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体,并进行体外培养。制备兔桡骨2cm长度的节段性骨缺损模型,分三组进行骨缺损治疗的研究：空白对照组(A组)不植入任何材料,单β-TCP人工骨对照组(B组),rADSCs/β-TCP复合体实验组(C组)。各组8只兔16例骨缺损。在手术后2周,4周,6周和8周时进行X线检查,按Lane-Sandhu X线评分法对骨愈合情况进行比较,X线检查后每组各选2只兔处死后取出标本,对标本进行大体观察以及进行常规HE染色,光镜下观察骨修复情况,并观察是否发生免疫排斥反应。结果：通过Lane-SandhuX线评分进行统计学分析,C组比B组在各时间点评分均略高,但其差异无统计学意义,其两组的评分均明显高于A组,手术后8周结果示A组与其它两组间差异均有统计学意义。组织学观察C组在术后4周可观察到骨缺损周围开始形成新生骨,并随着时间的延长新生骨量逐渐增多,在术后6周时,材料逐渐降解,材料孔隙内有新生骨长入,在术后8周时,材料降解明显,材料孔隙基本消失,髓腔已基本再通。而至术后8周,2例B组及4例A组骨缺损未愈合,髓腔不通,与实验组有明显差异。组织学检测未见免疫排斥现象。结论：将同种异体脂肪源性间充质干细胞为种子细胞,接种于β-TCP支架材料构建骨组织工程复合体,移植修复兔桡骨大段骨缺损部位。术后8周骨缺损部位完全修复,髓腔再通及塑形基本完成。组织学检测未见免疫排斥现象；ADSCs有望成为理想的修复骨缺损、促进骨折愈合的组织工程骨所需要的种子细胞,为大段骨缺损组织工程的修复提供可行的技术方案,为临床治疗骨缺损提供新的方法。
【关键词】：脂肪源性间充质干细胞 成脂分化 成骨分化 流式细胞仪 脂肪源性间充质干细胞 β-磷酸三钙 骨组织工程 脂肪源性间充质干细胞 骨组织工程复合体 大段骨缺损 β-磷酸三钙
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q813.11;R318.08
【目录】：

• 英文缩略词表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-13
• 前言13-15
• 第一部分 兔脂肪源性间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定以及多向诱导分化研究15-30
• 1 实验材料15-16
• 2 实验方法16-21
• 3 结果21-27
• 4 讨论27-29
• 5 小结29-30
• 第二部分 兔脂肪源性间充质干细胞在β-磷酸三钙支架上体外共培养,构建rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体及体外成骨分化的研究30-38
• 1 实验材料30-31
• 2 实验方法31-33
• 3 结果33-36
• 4 讨论36-37
• 5 小结37-38
• 第三部分 应用rADSCs/β-TCP骨组织工程复合体修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究38-54
• 1 实验材料38-39
• 2 实验方法39-42
• 3 结果42-51
• 4 讨论51-52
• 5 小结52-54
• 参考文献54-56
• 综述56-61
• 参考文献59-61
• 致谢61-62

【参考文献】

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1 毕晓娟;马艳;江明;;大鼠腹股沟脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及活体标记[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年14期

  本文关键词：同种异体脂肪源性间充质干细胞复合β-磷酸三钙支架修复兔桡骨大段骨缺损的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：301280