大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架构建组织工程骨的研究

发布时间：2017-04-14 14:15

  本文关键词：大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架构建组织工程骨的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:本研究以纳米羟基磷灰石、胶原蛋白、丝素蛋白为原料制备仿生骨组织工程三维支架,并评价支架材料的孔隙率、孔径大小、吸水率及生物力学性能。提取Wistar大鼠骨髓间充质干细胞并成骨方向诱导,检测细胞形态变化、碱性磷酸酶染色、钙结节染色及I型胶原和骨钙素表达鉴定成骨诱导活性。将成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞与制备支架复合培养以检测其细胞生物相容性及构建组织工程化骨的可行性。方法:1.三维支架材料的制备:冷冻干燥法制备纳米羟基磷灰石、胶原蛋白、丝素蛋白(Nano-HA、COL、SF)质量比分别为1:1:5(A组)、1:2:5(B组)及1:3:5(C组)三组复合支架。改良液体位移法测定支架孔隙率;质量差值法测量吸水膨胀率;Instron5865力学试验机测定力学性能;扫描电镜(SEM)观察支架内部微观结构。2.大鼠BMSCs细胞的提取及培养:脱颈法处死Wistar大鼠,无菌条件下提取股骨、胫骨内骨髓间充质干细胞,以10%胎牛血清的DMEM/F12培养基原代培养,并传代,传至第3代,待用。3.BMSCs细胞成骨方向诱导干预及分组:取生长良好的第3代BMSCs细胞,按1×105L-1的细胞浓度接种于无菌24孔板内,分为实验组与对照组2组;每组12孔,每组再各分4个亚组,需要染色的组别预先在孔内放入经灭菌处理的盖玻片。分别对各相应组内细胞作碱性磷酸酶(ALP)染色,钙结节茜素红染色,以及I型胶原和骨钙素表达的检测。干预措施为:实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12完全培养液培养;对照组则仅用含胎牛血清的DMEM/F12完全培养液培养。各组均每3天换细胞培养液1次,换液量相等。4.成骨诱导后的细胞接种于三维支架复合培养,分别于培养后的第2、4、6、8、12d做MTT细胞活性检测;另外取培养第8d的复合培养物作扫描电镜观察以及组织HE切片染色。结果:1.三组支架材料均为三维多孔结构,具有一定的孔径及孔隙率。B组支架更符合要求:孔径98~260μm,平均孔径为177μm;孔隙率为(96.72±2.78)%;吸水膨胀率为(549.37±35.29)%;生物力学试验机测定其力学性能稳定、压缩应变以及弹性模量等指标适宜骨组织工程研究应用。2.提取BMSCs细胞及诱导培养:提取的BMSCs原代细胞为单个核细胞,形态大部分为球形,25cm2培养瓶内体外培养1~3天后,可见细胞呈椭圆形、球形贴壁生长。继续培养后,圆形贴壁细胞的数量明显减少。培养5~7天后,形态以梭形为主。成骨诱导第2~3天后细胞形态发生改变,由梭形变为多角形,7天时以多角形为主。ALP染色可见多个胞质内、细胞核内染色均呈阳性表现。培养21天后作细胞爬片的茜素红染色钙结节,可见细胞染色呈深红色或橘红色的钙盐沉积,细胞与细胞之间呈团块状。结节团块的大小及形态不一,数个或多个矿化结节可融合成块。经检测I型胶原和骨钙素表达均呈阳性。3.诱导细胞与支架复合培养后扫描电镜及HE切片染色结果显示,支架内有大量细胞长入,生长状态良好,完全伸展。支架内部结构被一层细胞基质覆盖,孔与孔之间有细胞长入。MTT检测结果为细胞在一定时间内呈对数生长。结论:1.三组支架均为三维多孔结构,B组支架在孔径大小、孔隙率及力学性能等方面更适用于骨组织工程需求。2.经检测ALP、钙结节及骨钙素等指标验证所得细胞为成骨活性细胞,同时反向验证提取细胞为BMSCs,可用于构建骨组织工程化骨组织。3.细胞/支架复合培养后,细胞在支架内部生长良好,且分泌细胞外基质。该构建复合物有望应用于修复骨组织缺损。
【关键词】：纳米羟基磷灰石 胶原蛋白 丝素蛋白 组织工程支架 骨髓间充质干细胞 成骨诱导
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R68;R318.08
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 缩略语/符号说明9-10
• 前言10-14
• 研究现状、成果10-12
• 研究目的、方法12-14
• 一、Nano-HA/COL/SF复合三维多孔支架的制备14-28
• 1.1 对象和方法14-17
• 1.1.1 实验材料14
• 1.1.2 实验方法14-16
• 1.1.3 孔隙率、孔径大小等理化性能检测16-17
• 1.1.4 三维支架的生物力学检测17
• 1.1.5 统计学方法17
• 1.2 结果17-24
• 1.2.1 Nano-HA/COL/SF复合三维支架吸水膨胀率结果17-18
• 1.2.2 Nano-HA/COL/SF复合三维支架孔隙率结果18
• 1.2.3 Nano-HA/COL/SF复合三维支架物理大体外观18
• 1.2.4 Nano-HA/COL/SF复合三维支架孔径大小及微观结构18-19
• 1.2.5 Nano-HA/COL/SF复合三维支架的生物力学测试结果19-24
• 1.3 讨论24-27
• 1.3.1 支架材料复合的必要性24-25
• 1.3.2 支架材料制备的方法25-26
• 1.3.3 组织工程支架评价指标26-27
• 1.4 小结27-28
• 二、大鼠BMSCs细胞的提取培养及成骨方向诱导28-38
• 2.1 对象和方法28-31
• 2.1.1 实验材料28-29
• 2.1.2 实验方法29-30
• 2.1.3 BMSCs诱导后检测其成骨性30-31
• 2.1.4 统计学方法31
• 2.2 结果31-35
• 2.2.1 细胞形态变化观察31
• 2.2.2 碱性磷酸酶（ALP）染色结果31
• 2.2.3 茜素红钙结节染色31
• 2.2.4 I型胶原蛋白Western blotting结果31
• 2.2.5 骨钙素检测结果31-35
• 2.3 讨论35-37
• 2.3.1 种子细胞的选择与诱导35-36
• 2.3.2 BMSCs细胞诱导后鉴定结果的讨论36-37
• 2.4 小结37-38
• 三、成骨诱导细胞与支架复合培养及检测38-44
• 3.1 对象和方法38-39
• 3.1.1 实验对象38
• 3.1.2 实验方法38-39
• 3.1.3 统计学方法39
• 3.2 结果39-42
• 3.2.1 MTT法检测细胞增殖结果39-40
• 3.2.2 电镜扫描及HE切片结果40-42
• 3.3 讨论42-43
• 3.3.1 组织工程构建方式的讨论42
• 3.3.2 用于检测细胞-支架培养情况指标的讨论42-43
• 3.4 小结43-44
• 结论44-45
• 参考文献45-56
• 发表论文和参加科研情况说明56-58
• 综述 组织工程骨研究背景与进展58-67
• 综述参考文献65-67
• 致谢67

【参考文献】

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  本文关键词：大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架构建组织工程骨的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：306170