人胎盘源间充质干细胞与仿生丝蛋白材料在皮肤组织工程中的运用研究

发布时间：2017-04-15 04:04

  本文关键词：人胎盘源间充质干细胞与仿生丝蛋白材料在皮肤组织工程中的运用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：在大面积皮肤缺损的治疗研究中,因可用于移植的白体皮肤有限,组织工程已经成为了解决皮肤缺损修复的“良药”,在临床应用方面有着广阔的前景。寻找良好的种子细胞和支架材料是组织工程皮肤研究领域的两大重要关键点。丝素蛋白(Silk Fibroin, SF)具有良好的生物学特性,如生物相容性、降解性、可塑性等,成为构建组织工程皮肤的理想素材。种子细胞方面,人胎盘绒毛膜来源的问充质干细胞(Chorion Mesenchymal Stem cells, CMSCs)具有来源方便,制取容易,增殖分化能力强等特点,有作为皮肤组织工程种子细胞的潜力。因此,本论文选取丝素蛋白(SF)纳米纤维材料为支架,CMSCs为种子细胞,重点研究SF材料对种子细胞CMSCs生物学特性的影响,探讨CMSCs与仿生SF材料的生物相容性及其在皮肤损伤修复中的作用。第一部分人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的体外分离培养与生物学特性鉴定目的：从人足月胎盘绒毛膜中分离绒毛问充质干细胞(CMSCs),建立相应的扩增体系,并对CMSCs生物学特性进行鉴定。方法：取健康产妇正常剖宫产足月胎儿的新鲜胎盘组织,钝性分离羊膜层与绒毛膜层,对绒毛膜组织进行消化及体外培养,倒置显微镜观察体外培养绒毛膜问充质干细胞(CMSCs)的细胞形态；RT-PCR分析CMSCs中干细胞基因OCT4、 SOX2和NANOG的表达；流式细胞仪分别检测其表面标志；采用多种诱导条件诱导CMSCs向脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞方向诱导,并用特异性染色法对诱导后细胞进行鉴定。结果：(1)成功分离培养了CMSCs,体外培养实验中CMSCs呈典型的成纤维细胞样贴壁生长,状态良好且具有较快的增殖速度；(2)RT-PCR结果显示,CMSCs表达干细胞特性基因OCT、SOX2和NANOG;(3)流式细胞术检测体外培养的CMSCs高表达CD90、CD73和CD105,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR;(4)体外扩增培养的CMSCs成骨诱导后,细胞形态均由长梭形向立方形转变,经茜素红S染色可见细胞集落生长并出现钙结节；成软骨诱导21天后,CMSCs在离心小管中团聚形成小块软骨样组织,经甲苯胺蓝染色后可见阳性细胞表达Ⅱ型胶原；成脂肪诱导2周后,培养的CMSCs细胞内有明显的脂滴出现,油红O染色阳性；CMSCs诱导分化为内皮细胞21天后,在基质胶上形成毛细血管样结构。结论：通过酶消化成功获取人CMSCs并在体外传代扩增,RT-PCR、流式细胞术及诱导分化结果提示获得的CMSCs表达干细胞标志分子并具有一定的多向分化能力,为组织工程提供良好的种子细胞。形态均由长梭形向立方形转变,经茜素红S染色可见细胞集落生长并出现钙结节；成软骨诱导21天后,CMSCs在离心小管中团聚形成小块软骨样组织,经甲苯胺蓝染色后可见阳性细胞表达Ⅱ型胶原；成脂肪诱导2周后,培养的CMSCs细胞内有明显的脂滴出现,油红O染色阳性；CMSCs诱导分化为内皮细胞21天后,在基质胶上形成毛细血管样结构。第二部分仿生丝素蛋白材料与绒毛间充质干细胞间的相容性及其在修复皮肤损伤中的作用目的：研究仿生丝素蛋白纳米纤维对CMSCs细胞生物学行为的影响,并探索其在皮肤组织损伤修复中的作用。方法：以天然蚕丝纳米原纤结构为基础,通过溶液浓度实现静电纺纤维直径的有效调控,获得不同纳米尺度的静电纺丝素蛋白纤维材料。应用酶消化法从胎盘绒毛膜中提取CMSCs,并在体外培养和传代扩增后接种在不同直径仿生丝素蛋白纳米纤维材料上,培养不同时问后进行检测分析。分别采用倒置显微镜观察细胞的黏附生长及增殖情况,用CCK8法绘制生长曲线,采用激光共聚焦显微镜观察细胞铺展及细胞骨架结构,采用流式细胞仪检测生长于SF材料上CMSCs的表型,通过以上测试分析揭示材料微纳结构对细胞生物学行为的影响。选取利于细胞黏附生长维纳结构的SF材料,并制作不同疏密程度的SF材料后植入大鼠皮肤损伤处,观察记录创面修复情况并通过组织切片HE染色检测材料在皮肤损伤修复中的作用。结果：(1)通过改变溶液浓度制作出不同直径大小的仿生SF纳米纤维支架；(2)综合运用静电纺丝技术、冷冻干燥技术、超声波首次制取不同三维空间结构的SF纳米纤维材料；(3)CMSCs接种于仿生SF纤维材料后,细胞正常黏附生长和铺展并有效增殖,流式细胞仪分析接种与仿生SF的CMSCs表型未改变,表明仿生SF纳米纤维材料与CMSCs问具有优异的生物相容性；(4)大鼠皮肤损伤修复的实验表明,植入仿生SF材料的创面修复愈合程度更快更好的特性,并且无明显的炎症反应。结论：不同直径大小的仿生丝素蛋白材料与CMSCs具有良好的生物相容性,将其植入皮肤应用于皮肤损伤修复的覆盖填充物,为进一步研究仿生丝素蛋白纳米纤维材料在皮肤组织工程中的应用提供了理论依据。
【关键词】：人绒毛间充质干细胞 生物学特性 分化 人绒毛间充质干细胞 丝素蛋白纳米纤维 皮肤损伤修复
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R622
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-25
• 皮肤组织工程中的种子细胞13-16
• 皮肤组织工程支架材料16-19
• 小结19-20
• 参考文献20-25
• 第一部分 人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的体外分离培养与生物学特性鉴定25-38
• 一、材料和试剂25-26
• 二、实验方法26-29
• 三、结果29-32
• 四、讨论32-33
• 参考文献33-38
• 第二部分 仿生丝蛋白材料与人绒毛膜间充质干细胞间的相容性及在皮肤损伤修复中的作用研究38-55
• 一、材料和试剂38-39
• 二、实验方法39-41
• 三、结果41-51
• 四、讨论51-53
• 参考文献53-55
• 结语55-57
• 小结55
• 创新性55-57
• 硕士学位学习期间发表的论文57-58
• 本课题的受资助情况58-59
• 英文缩写词表59-60
• 致谢60-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 ;Full-thickness tissue engineered skin constructed with autogenic bone marrow mesenchymal stem cells[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2007年04期

2 李青;黄杰;何飞;贺庆梅;曹传宝;王松;;释药用丝素水凝胶的制备及体内外形态研究[J];生物医学工程学杂志;2013年04期

3 蔡霞,曹谊林,崔磊,刘伟,关文祥;Use of autologous tissue engineered skin to treat porcine full-thickness skin defects[J];Chinese Journal of Traumatology;2005年05期

4 曹谊林,蔡霞,崔磊,商庆新,刘伟,关文祥;自体组织工程化全层皮肤缺损修复实验研究[J];中华外科杂志;2002年01期

  本文关键词：人胎盘源间充质干细胞与仿生丝蛋白材料在皮肤组织工程中的运用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：307553