可降解材料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）医用生物安全性研究

发布时间：2017-04-16 11:20

  本文关键词：可降解材料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）医用生物安全性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的体外细胞相容性评价 目的体外细胞生物学相容性评价是医用材料生物相容性评价体系中的一项重要内容,具有操作简便、敏感性高和研究周期短等优点,广泛应用于材料临床应用前的生物安全性评价。本部分采用体外细胞共培养的方法,研究聚丁二酸丁二醇酯[poly (butylene succinate), PBS]的细胞相容性,并为后续研究奠定基础。 方法以THP-1细胞和CHO细胞作为实验细胞,分别与不同浓度的PBS材料浸提液(0mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml)体外共培养48小时,同时将细胞直接种植于材料表面培养24小时和72小时,利用相差显微镜和扫描电镜分别观察细胞形态变化和材料表面粘附的细胞数量及延展性；通过MTT实验分别研究不同浓度的材料浸提液(3.1mg/ml、6.2mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml)对实验细胞的毒性；采用EdU方法评价最大浓度PBS浸提液(200mg/ml)共培养后的细胞相对增殖率,流式细胞仪技术(Flow Cytometry,FCM)和Hoechst33342染色方法检测最大浓度PBS浸提液共培养24小时、48小时和72小时后的细胞凋亡情况。 结果①各浓度浸提液共培养48小时后,两种细胞相差显微镜下形态正常,增殖旺盛；PBS材料表面粘附的细胞数量随时间延长逐渐增多,延展性良好,但在培养72小时后,少数THP-1细胞形态呈现三角形或不规则改变。 ②与最大浓度PBS材料浸提液共培养72小时后,CHO细胞和THP-1细胞的相对存活率分别为(93.2±2.3)%和(81.2±5.3)%,与相同实验条件医用级L-PLA浸提液组结果无统计学差异,(P0.05)；且PBS材料浸提液对实验细胞均不存在半数细胞增殖抑制浓度(50%concentration of inhibition, IC50)。 ③与最大浓度PBS材料浸提液共培养的CHO细胞,随时间延长均出现不同程度细胞凋亡；THP-1细胞也出现不同程度细胞凋亡,其中72小时时细胞凋亡率明显高于24小时和48小时,(P0.05)。 结论本实验条件下,PBS材料浸提液对CHO细胞和THP-1细胞的形态、增殖/凋亡影响较小,显示出良好的体外细胞相容性；但相同条件下,THP-1细胞对该材料具有较强的敏感性。 第二部分聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的体外遗传毒性研究 目的遗传毒性评价是生物材料长期临床应用安全的基本保证,主要包括致癌性和致突变性,是材料生物相容性研究的一项重要内容。本部分通过体外细胞共培养方法,研究聚丁二酸丁二醇酯[poly (butylene succinate), PBS]的体外遗传毒性。 方法在代谢活化系统存在和缺乏条件下,分别检测最大浓度(200mg/ml) PBS材料浸提液共培养24小时和48小时后CHO细胞的染色体畸变；以ZnSO4·7H2O的IC25(22ug/ml)剂量作为阳性对照,吖啶橙(Acridine Orange, AO)染色研究最大浓度PBS材料浸提液对CHO细胞的微核形成影响。以实时定量聚合酶链式反应(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)方法分别检测PBS材料浸提液共培养后CHO细胞P53、Survivn基因及蛋白的表达变化；以RT-qPCR方法检测PBS材料浸提液对THP-1细胞凋亡相关基因Bax、Bc1-2、Smac和IAP-1的表达变化。 结果①代谢活化系统存在和缺乏条件下,PBS材料浸提液诱发CHO细胞的染色体畸变率均小于5%,对该细胞无致突变性。 ②CHO细胞最大浓度PBS浸提液共培养72小时后出现微核的细胞数为(1.62±1.01),与F12/DMEM组和L-PLA组相比均无差异(P0.05),明显低于ZnSO4·7H2O IC10剂量组(25.45±3.23),(P0.05)。 ③浸提液共培养后CHO细胞P53、Survivn基因及蛋白表达与F12/DMEM对照组相比,均没有明显变化(P0.05)。 ④浸提液共培养后THP-1细胞凋亡相关基因与RPMI-1640对照组相比,抗凋亡基因Bcl-2表达下调(P0.05),促凋亡基因Bax表达上调(P0.05),而IAP-1和Smac基因表达则无明显变化,(P0.05)。 结论本实验条件下,PBS材料浸提液对CHO细胞的染色体行为作用较小,无致突变性,不影响其癌相关基因和蛋白表达变化。该材料浸提液不诱发THP-1细胞抗凋亡基因的过表达,无致癌性；促凋亡基因Bax上调,抗凋亡基因Bcl-2下调可能是其诱发该细胞凋亡的分子机制。 第三部分聚丁二酸丁二醇酯(PBS)体内毒性研究 目的动物体内实验依然是目前评价生物材料安全性的重要手段,其结果更具有科学性和可信度。本部分以ICR小鼠为研究对象,以灌胃染毒方法研究聚丁二酸丁二醇酯[poly (butylene succinate), PBS]的急慢性毒性,以及骨髓染色体畸变和淋巴细胞微核形成的影响,并进一步验证体外评价的实验结果。 方法将ICR小鼠分为生理盐水组、L-PLA浸提液组、PBS浸提液组和环磷酰胺阳性对照组,以小鼠最大灌胃容量染毒7天,通过小鼠一般情况,组织病理、骨髓染色体畸变和淋巴细胞微核评价PBS材料的体内毒性。 结果染毒期间PBS材料浸提液组小鼠一般情况良好,重要脏器无病理变化；其染色体畸变率为(4.4±1.6)%,与生理盐水组和L-PLA浸提液组相比无统计学差异(P0.05)；PBS浸提液组小鼠淋巴细胞的微核细胞数为(5.52±4.01),与生理盐水组和L-PLA组相比无差异(P0.05),明显低于环磷酰胺对照组(31.84±5.37)(P0.05)。 结论本实验条件下,PBS材料对ICR没有毒性和致突变性,其结果与体外评价结果的趋势一致。
【关键词】：聚丁二酸丁二醇酯 形态 增殖 凋亡 聚丁二酸丁二醇酯 染色体畸变实验 骨髓微核试验 凋亡相关基因 蛋白 聚丁二酸丁二醇酯 动物实验 染色体畸变实验 微核试验
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 引言6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-16
• 第一部分 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的体外细胞相容性评价16-33
• 1. 实验材料和仪器16-18
• 2. 实验方法及步骤18
• 3. PBS的体外细胞相容性研究18-21
• 4. 统计学分析21
• 5. 实验结果21-27
• 6. 讨论27-30
• 7. 参考文献30-33
• 第二部分 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的体外遗传毒性研究33-51
• 1. 实验材料和仪器33-35
• 2. 实验方法及步骤35-40
• 3. 实验结果40-44
• 4. 讨论44-47
• 5. 参考文献47-51
• 第三部分 聚丁二酸丁二醇酯(PBS)体内毒性研究51-61
• 1. 实验材料和仪器51-52
• 2. 实验方法及步骤52-54
• 3. 统计学分析54
• 4. 实验结果54-58
• 5. 讨论58-59
• 6. 参考文献59-61
• 结论61-62
• 综述62-69
• 参考文献65-69
• 缩略词表69-70
• 个人简历70-71
• 硕士研究生期间奖励及发表文章71-72
• 致谢72

【参考文献】

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9 赵宏宇;赵s

本文编号：310718