人脂肪组织细胞外基质支架的制备与检测及其在大鼠软组织缺损模型中降解的实验研究

发布时间：2017-04-22 19:03

  本文关键词：人脂肪组织细胞外基质支架的制备与检测及其在大鼠软组织缺损模型中降解的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1.制备人脂肪组织细胞外基质支架并初步检测其脱细胞效果、成分、机械性能等指标;2.探讨人脂肪组织细胞外基质支架对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的生物相容性及其对hADSCs成脂分化能力的影响;3.建立大鼠软组织缺损模型,探讨人脂肪组织细胞外基质支架于缺损软组织模型内生物降解性。方法:1.取正常脂肪组织约25g经反复冻融、酶消化、有机溶剂提取脂质、冷冻干燥等处理制备成人脂肪组织细胞外基质支架。大体观察支架性状,行HE、Masson染色、DAPI荧光染色观察支架脱细胞效果;免疫组织化学染色观察细胞外基质(Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白)保留情况;扫描电镜观察支架显微结构;万能力学试验机测试支架机械性能;2.利用酶消化法从人体健康脂肪组织中分离提取出hADSCs,扩增培养、观察细胞形态、检测细胞免疫表型;定向诱导hADSCs成脂及成骨分化,油红O、茜素红染色鉴定;取第3代hADSCs与人脂肪组织细胞外基质支架复合培养,CCK-8检测细胞增殖活性;扫描电镜观察细胞粘附情况并成脂诱导,14d后行细胞支架复合物冰冻切片,油红O染色,RT-PCR检测成脂特异性基因PPARγ、LPL mRNA表达情况;3.取清洁级雌性Wistar大鼠18只,于左侧背部切除竖脊肌部分肌肉,建立软组织缺损模型,分别于4w、8w、12w观察肌肉缺损愈合情况;另取清洁级雌性Wistar大鼠18只,于左侧背部建立软组织缺损模型,将支架植入其中;右侧直接将支架植入皮下;分别于4w、8w、12w取出植入支架,大体观察两侧支架降解情况,比较两组支架湿重,行HE染色观察支架内炎性浸润情况。结果:1.脂肪组织细胞外基质支架呈海绵样多孔结构;HE及Masson染色未见明显细胞结构,可见排列紧密的基质蛋白;DAPI荧光染色未见明显阳性细胞核,脱细胞彻底;免疫组织化学染色显示支架材料Ⅳ型胶原蛋白、层粘连蛋白染色呈阳性结果;扫描电镜观察支架呈多孔泡沫样结构,孔隙相互连接,孔径约50-60μm;万能力学试验机测定支架最大载荷值低于脂肪组织;2.胶原酶消化法可成功从脂肪组织中分离培养出hADSCs,细胞贴壁生长,原代呈短梭形,传代培养后呈长梭形;流式细胞仪检测免疫表型,其中CD44、CD90阳性,CD34、CD45阴性;hADSCs成脂、成骨定向诱导分化后,油红O、茜素红染色阳性。细胞与支架复合培养后,CCK-8检测显示A值随时间延长不断升高,细胞生长良好,基质支架对细胞无毒性;扫描电镜可见大量细胞粘附于支架;成脂诱导支架细胞复合物,油红O染色可见支架内大量红染脂滴;RT-PCR显示LPL、PPARγmRNA显著高表达;3.大鼠软组织缺损模型建立后,分别于4w、8w、12w观察可见软组织缺损持续存在,未能自行填充修复;将支架植入组织缺损及皮下后分别于4w、8w、12w取材,可见植入组织缺损处支架及皮下支架表面皆形成包膜,通过大体观察,比较湿重,可见缺损组支架降解明显快于皮下组,HE染色缺损组支架炎性浸润明显高于皮下组,两组支架均未完全降解。结论:1.利用脱细胞技术制备的人脂肪组织细胞外基质支架脱细胞彻底,具有良好的三维空间结构,细胞外基质成分保留完好,机械性能较正常脂肪组织有所下降;2.细胞在支架上增殖、粘附、分化良好,支架生物相容性能良好;3.大鼠软组织缺损模型建立有效,支架在体内生物降解性能良好。
【关键词】：脂肪组织工程 脱细胞 细胞外基质 支架 间充质干细胞 软组织缺损
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R687
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-8
• 缩略词表8-12
• 前言12-15
• 第一部分 人脂肪组织细胞外基质支架的制备与检测15-20
• 1 材料和方法15-17
• 1.1 材料15
• 1.2 主要试剂和仪器15-16
• 1.3 实验方法16-17
• 1.3.1 人脂肪组织细胞外基质支架的制备16
• 1.3.2 大体观察16
• 1.3.3 组织学观察16
• 1.3.4 DNA残留观察16
• 1.3.5 免疫组织化学染色观察16
• 1.3.6 扫描电镜观察16
• 1.3.7 机械性能检测16-17
• 1.3.8 统计学分析17
• 2 结果17-18
• 2.1 大体观察17
• 2.2 组织学观察17
• 2.3 DNA残留观察17
• 2.4 免疫组织化学染色观察17
• 2.5 扫描电镜观察17-18
• 2.6 机械性能检测18
• 3 讨论18-20
• 第二部分 人脂肪间充质干细胞与人脂肪组织细胞外基质支架生物相容性的体外研究20-27
• 1 材料与方法20-23
• 1.1 材料来源20
• 1.2 主要试剂和仪器20-21
• 1.3 实验方法21-23
• 1.3.1 hADSCs的分离、培养21
• 1.3.2 hADSCs的表型鉴定21
• 1.3.3 hADSCs定向成脂诱导分化21-22
• 1.3.4 hADSCs定向成骨诱导分化22
• 1.3.5 人脂肪组织细胞外基质支架的制备22
• 1.3.6 支架对细胞毒性测定22
• 1.3.7 细胞粘附观察22
• 1.3.8 细胞外基质支架上细胞成脂分化观察22
• 1.3.9 RT-PCR检测成脂基因表达情况22-23
• 1.3.0 统计学分析23
• 2 结果23-24
• 2.1 hADSCs的分离、培养23-24
• 2.2 hADSCs的表型鉴定24
• 2.3 hADSCs成脂诱导分化24
• 2.4 hADSCs成骨诱导分化24
• 2.5 支架对细胞毒性测定24
• 2.6 细胞粘附观察24
• 2.7 细胞外基质支架上细胞成脂分化观察24
• 2.8 RT-PCR检测基因表达分析24
• 3 讨论24-27
• 第三部分 人脂肪组织细胞外基质支架在大鼠软组织缺损模型中降解的实验研究27-32
• 1 材料与方法27-29
• 1.1 材料来源27
• 1.2 主要试剂和仪器27-28
• 1.3 实验方法28-29
• 1.3.1 人脂肪组织细胞外基质支架的制备28
• 1.3.2 支架材料的处理28
• 1.3.3 大鼠软组织缺损模型的建立28
• 1.3.5 软组织缺损模型大体观察28
• 1.3.6 植入体内支架降解观察28-29
• 1.3.7 体内降解支架材料HE染色29
• 1.3.8 统计学分析29
• 2 实验结果29-30
• 2.1 大鼠软组织缺损模型大体观察29
• 2.2 体内植入支架降解大体观察29
• 2.3 体内降解支架材料HE染色29-30
• 3 讨论30-32
• 结论32-33
• 参考文献33-37
• 在学期间的研究成果37-38
• 致谢38-39
• 综述39-45
• 参考文献43-45
• 附图45-53

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本文编号：321046