应用骨髓间充质干细胞构建人工复合皮的实验研究

发布时间：2017-04-23 15:04

  本文关键词：应用骨髓间充质干细胞构建人工复合皮的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 将骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）与脱细胞猪小肠黏膜下层组织(Small Intestinal Submucosa, SIS)在体外复合培养构建人工复合皮肤，并应用于兔全层皮肤缺损创面。全面观察其修复创面的能力，从而验证其作为人工复合皮肤的可行性。 方法： （1）利用骨髓穿刺法抽取兔胫骨近端或股骨远端骨髓，再运用密度梯度离心法及差速贴壁法分离纯化BMSCs。用含10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum,FBS)的DMEM/F-12培养基对其进行培养，37℃、5%CO2的饱和湿度恒温培养箱对其进行孵育，体外培养扩增至第三代。观察各代细胞形态及生长情况并对纯化后的第三代细胞进行体外鉴定。用含绿色荧光蛋白（Green FluorescentProtein, GFP）基因的慢病毒对第三代BMSCs进行转染，将其标记，达到示踪效果。 （2）利用酶-去垢剂法制备脱细胞SIS，并行HE染色及电镜检查检测脱细胞是否彻底。以密度为106/cm2将GFP-BMSCs接种于已脱细胞处理的SIS上共培养10天以构建人工复合皮肤，，荧光显微镜及电子显微镜下观察GFP-BMSCs在SIS中的定植情况。 （3）在日本大耳兔背部脊柱两侧制备3个全层皮肤缺损模型并随机分组，分为A、B、C三组。A、B组创面分别移植人工复合皮肤，单纯脱细胞SIS，C组为空白创面。术后观察全层皮肤缺损创面愈合情况，并记录各组创面完全愈合时间行统计学分析。分别于术后7、14、21、28天对各组创面大小进行测量，计算各个时间点的创面收缩率（创面收缩率=（原创面面积-现创面面积）/原始创面面积×100％）并进行统计学分析。同时在上述各个时间点进行创面组织取材，观察各组创面组织的情况如质地、厚度并进行比较分析，然后行HE染色组织学检查，观察各组创面在愈合过程中的组织学结构的改变情况。 结果： （1）运用密度梯度离心法及差速贴壁法分离纯化BMSCs，倒置显微镜下观察BMSCs呈梭形，生长良好，细胞克隆生长融合后可呈“鱼群样”排列；传代培养时5-6天即可达80%融合，且随着传代，BMSCs的形态趋为均一。分离纯化后的BMSCs能向脂肪细胞及成骨细胞分化。荧光显微镜下见转染标记后的BMSCs生长良好，荧光强。 （2）制备的脱细胞SIS，HE染色及扫描电镜下观察均未见细胞残留。人工复合皮肤成功构建：荧光显微镜下见GFP-BMSCs能粘附定植于SIS并在其表面伸展，生长良好；共培养10天后扫描电镜下见多量细胞粘附于SIS的胶原纤维上，多呈梭形。 （3）创面修复实验中，A、B、C组创面完全愈合时间分别为20.83±1.17d，23.50±1.05d，27.67±1.03d，A组创面愈合时间明显比其他两组短，与其他两组相比具有明显差异（P0.01）。在术后7、14、21、28天创面收缩率的比较中，A组与其他两组相比均更小，差异非常显著（P0.01）。在术后7、14、21、28天创面组织厚度的比较上，A组与其他两组相比均更软，更薄（与B组相比，P0.05，差异显著；与C组相比较，P0.01，差异非常显著）。即A组创面愈合时间短，创面收缩率小，创面组织较软、薄。HE染色显示，A组创面愈合前期上皮化速度快，中后期毛细血管及小血管增殖丰富，胶原纤维改建快，与其它两组有明显差异。 结论： （1）密度梯度法及差速贴壁法简单易行，可以较高纯度地分离扩增BMSCs，分离的BMSCs活力好，增殖能力强。 （2）酶-去垢剂法可以有效彻底地脱去SIS中的细胞。BMSCs与SIS在体外复合培养可构建人工复合皮。 （3）利用BMSCs构建的复合皮修复全层缺损创面时，能促进小血管形成及创面上皮化，加速创面愈合；能降低创面收缩率，使创面组织更薄及柔软，从而能改善愈合质量。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 人工复合皮肤 全层皮肤缺损 创面修复
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.1
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料和方法13-19
• 2.1 主要试剂、主要仪器及标本来源13-14
• 2.2 BMSCs 的分离、扩增，鉴定及转染标记14-16
• 2.2.1 BMSCs 的分离、扩增14-15
• 2.2.2 BMSCs 的鉴定15-16
• 2.2.3 BMSCs 的标记16
• 2.3 脱细胞 SIS 的制备及人工复合皮肤的构建16-17
• 2.3.1 脱细胞 SIS 的制备16-17
• 2.3.2 人工复合皮的体外构建17
• 2.4 人工复合皮肤的创面修复实验17-19
• 2.4.1 动物创面修复实验17-18
• 2.4.2 实验观察指标18
• 2.4.3 统计学处理18-19
• 第3章 实验结果19-25
• 3.1 BMSCs 的分离、扩增，鉴定及转染标记19-20
• 3.1.1 BMSCs 的分离，扩增19
• 3.1.2 BMSCs 的鉴定19-20
• 3.1.3 BMSCs 的转染标记20
• 3.2 脱细胞 SIS 的制备及人工复合皮肤的构建20-21
• 3.2.1 脱细胞 SIS 的制备20
• 3.2.2 人工复合皮的体外构建20-21
• 3.3 人工复合皮肤的创面修复实验21-25
• 3.3.1 实验大体观察21-22
• 3.3.2 不同时间点各组创面面积22
• 3.3.3 各个时间点各组创面收缩率的比较分析22-23
• 3.3.4 各个时间点各组创面组织质地及厚度的比较分析23
• 3.3.5 各组创面完全愈合时间及比较分析23-24
• 3.3.6 HE 染色组织学观察24-25
• 第4章 讨论25-31
• 4.1 种子细胞的选择25-26
• 4.2 真皮支架的选择26-27
• 4.3 实验结果讨论27-31
• 第5章 结论及展望31-32
• 致谢32-33
• 参考文献33-35
• 附图35-41
• 攻读学位期间的研究成果41-42
• 综述42-51
• 参考文献47-51

【参考文献】

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本文编号：322565