VEGF165基因修饰的hADSCs与改性丝素蛋白支架材料构建血管化组织工程脂肪的实验研究

发布时间：2017-04-27 01:07

  本文关键词：VEGF165基因修饰的hADSCs与改性丝素蛋白支架材料构建血管化组织工程脂肪的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探讨VEGF165基因修饰的人脂肪间充质干细胞(hADSCs)与改性丝素蛋白支架材料构建血管化组织工程脂肪的可行性。方法：1.分离、培养及鉴定人脂肪间充质干细胞(hADSCs),选择生长良好的P3 hADSCs,接种于壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料(CS/SF),MTT法检测细胞在CS/SF上的粘附和增殖能力。成脂诱导14天后电镜及光镜分别观察细胞在支架材料上的粘附和生长,以评估支架材料与hADSCs的生物相容性。2.携带重组人VEGF165基因的慢病毒感染P3 hADSCs,将细胞与支架材料体外培养。实验分三步,第一步：将P3 hADSCs(对照组C1)及慢病毒感染(MOI=50)的P3 hADSCs(实验组E1)分别行成脂诱导,14天后行油红0染色,检测慢病毒感染对hADSCs成脂能力的影响。第二步：将P3 hADSCs(对照组C2)与慢病毒感染的P3 hADSCs(实验组E2)分别接种于支架材料上,MTT法评估慢病毒感染后,对hADSCs在支架材料上增殖能力的影响；第三步：C2组及E2组细胞-支架复合物体外成脂诱导,分别作为对照组C3及实验组E3,14天后,采用RT-PCR检测成脂特异性基因PPARγ-2并行油红0染色,评估慢病毒感染对hADSCs在支架材料上成脂能力的影响。3.体内实验。取24只雌性Wistar大鼠,每组12只。将上述C3、E3两组细胞—支架复合物体外成脂诱导5天后分别移植入大鼠背部皮下,移植后8周、12周分别取材并观察移植物,同时观察支架材料的降解情况,移植物行冰冻切片、HE染色、油红0染色及扫描电镜观察。Western Blot检测VEGF165及PPARγ-2蛋白的表达。结果1.hADSCs接种于支架材料后,在支架材料上粘附、增殖良好。成脂诱导14天后,油红0染色表明壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料上有大量脂肪细胞生成,扫描电镜下亦可见成熟脂肪细胞生成。2.感染72h后,荧光显微镜下即可见El组hADSCs呈现微弱的绿色荧光,96h后荧光明显增强。成脂诱导14天后,E1组和C1组均可见大量成熟脂肪细胞,两组无统计学差异(P0.05),慢病毒感染对hADSCs成脂能力无影响；MTT试验表明,慢病毒感染后,实验组E2和对照组C2细胞支架材料上增殖无统计学差异(P0.05)；油红0染色及RT-PCR均表明：实验组和对照组细胞—支架复合物体外成脂诱导后,均可见大量成熟脂肪细胞生成,两组无统计学差异(P0.05)。3.体内实验：植入体内8周及12周后,Western Blot结果显示实验组移植物均表达VEGF165,对照组未见表达；实验组及对照组均表达PPARγ-2,实验组中的表达量明显多于对照组(P0.05)。扫描电镜、油红0染色及HE染色均表明实验组及对照组均生成大量脂肪样细胞,且实验组明显多于对照组(P0.05)。结论1.CS/SF支架材料具有良好的生物相容性,hADSCs在CS/SF支架材料上粘附、增殖良好。2.携带重组人VEGF165基因的慢病毒感染hADSCs后,接种于支架材料,在体外能成功构建组织化工程脂肪。3.携带重组人VEGF165基因的慢病毒感染的hADSCs与CS/SF支架材料复合物在大鼠体内可持续表达VEGF165及PPARγ-2蛋白,能显著促进工程化脂肪组织的构建,为构建血管化组织工程脂肪奠定了基础。
【关键词】：血管化组织工程脂肪 VEGF165 壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料 慢病毒
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-12
• 前言12-14
• 第一部分 壳聚糖修饰的丝素蛋白支架材料与hADSCs生物相容性的研究14-19
• 1 材料和方法14-16
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 主要试剂和仪器14-15
• 1.2 实验方法15-16
• 1.2.1 hADSCs的分离、培养15
• 1.2.2 hADSCs的鉴定15
• 1.2.3 改性丝素蛋白支架材料的处理及电镜观察15-16
• 1.2.4 MTT法检测hADSCs在CS/SF上的粘附与增殖16
• 1.2.5 hADSCs-CS/SF成脂诱导后光镜、电镜观察16
• 2 数据处理16
• 3 结果16-18
• 3.1 hADSCs的分离及培养16-17
• 3.2 hADSCs的鉴定17
• 3.3 CS/SF支架的扫描电镜观察17
• 3.4 MTT法检测hADSCs在CS/SF上的粘附与增殖17
• 3.5 hADSCs-CS/SF成脂诱导在CS/SF支架上的生长状况及扫描电镜观察17-18
• 4 讨论18-19
• 第二部分 VEGF165基因修饰的hADSCs与改性丝素蛋白支架材料体外构建组织工程脂肪的研究19-25
• 1 材料和方法19-21
• 1.1 材料19-20
• 1.1.1 主要试剂和仪器19-20
• 1.2 实验方法20-21
• 1.2.1 hADSCs的分离、培养及鉴定20
• 1.2.2 慢病毒感染hADSCs20
• 1.2.3 慢病毒感染hADSCs后成脂诱导20
• 1.2.4 MTT法检测慢病毒感染后hADSCs在支架材料上的增殖20
• 1.2.5 慢病毒感染的hADSCs在支架材料上成脂诱导20-21
• 1.2.6 RT-PCR检测成脂特异性基因PPARγ-2的表达21
• 2 统计学分析21
• 3 结果21-23
• 3.1 慢病毒感染hADSCs21-22
• 3.2 慢病毒感染hADSCs后成脂诱导22
• 3.2.1 倒置显微镜观察22
• 3.2.2 油红O染色22
• 3.3 MTT法检测慢病毒感染的hADSCs在支架材料上的增殖22
• 3.4 慢病毒感染的hADSCs在支架材料上成脂诱导22-23
• 3.4.1 油红O染色22
• 3.4.2 RT-PCR22-23
• 4 讨论23-25
• 第三部分 VEGF165基因修饰的hADSCs与改性丝素蛋白体内构建血管化组织工程脂肪的研究25-31
• 1 材料和方法25-27
• 1.1 材料25-26
• 1.1.1 主要试剂和仪器25-26
• 1.2 方法26-27
• 1.2.1 hADSCs的分离、培养及鉴定26
• 1.2.2 慢病毒感染人脂肪间充质干细胞26
• 1.2.3 支架材料的处理26
• 1.2.4 细胞与支架材料的复合培养及成脂诱导26
• 1.2.5 CM-DIL标记细胞26
• 1.2.6 细胞-支架材料复合物移植26
• 1.2.7 移植物观察26-27
• 1.2.8 免疫印迹法检测VEGF165、PPARγ-2蛋白27
• 2 统计学分析27
• 3 结果27-29
• 3.1 CM-DIL标记的细胞-支架复合物27
• 3.2 移植物大体观察27-28
• 3.3 移植物组织学观察28
• 3.3.1 荧光显微镜下观察28
• 3.3.2 油红O-HE染色28
• 3.3.3 HE染色28
• 3.3.4 扫描电镜28
• 3.4 移植物中VEGF165、PPAR γ-2蛋白的表达28-29
• 4 讨论29-31
• 结论31-32
• 参考文献32-35
• 综述35-41
• 参考文献39-41
• 在学期间的研究成果41-42
• 致谢42-43
• 附图43-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 陶忠芬,蔡永国,杨仕明,可金星,黄文琪,肖桃元,房殿春;树突状细胞扫描电镜样本制备方法[J];第三军医大学学报;2005年12期

2 刘毅;肖宏涛;薛美思;;适宜于构建组织工程化脂肪的蚕丝蛋白支架:最佳孔径筛选[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年08期

3 徐红珍;苏俭生;;组织工程骨的血管化研究进展[J];中华临床医师杂志(电子版);2010年04期

4 刘毅;唐军;李世龙;;基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪[J];中国组织工程研究;2013年14期

  本文关键词：VEGF165基因修饰的hADSCs与改性丝素蛋白支架材料构建血管化组织工程脂肪的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：329591