利用人胚胎干细胞来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系追踪成年造血过程

发布时间：2021-11-09 04:09

　　Runt相关转录因子1c（Runt-related transcription factor 1c,Runx1c）与成年造血以及造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）的产生密切相关,为了动态追踪人早期造血发育过程中Runx1c的表达,利用双切质粒载体联合瞬时转入B细胞淋巴瘤-特大（B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL）基因的CRISPR-Cas9技术高效地构建了人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系,并经PCR、Sanger测序验证构建成功。随后,利用免疫荧光技术、实时荧光定量PCR技术、流式细胞术、畸胎瘤实验和数字化核型分析技术进行验证,发现该报告细胞系仍具有hESC样的多能性且未发生染色体异常和变异。此外,通过hESC体外单层诱导造血分化方法,利用流式细胞术追踪人早期造血发育过程中Runx1c的表达,结果表明利用该报告细胞系可以动态追踪人早期造血发育中Runx1c的表达。研究结果为阐明成年造血过程提供了新思路,并为体外产生功能性血细胞... 

【文章来源】：生物技术进展. 2020,10(05)

【文章页数】：10 页

【部分图文】：

利用H1-hESC来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系追踪成年造血过程

由2.1可知,通过CRISPR-Cas9方法成功获得了H1-hESC来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系,并且,其可在Matrigel包被的E8培养基中无限传代。镜下观察发现,细胞仍然具有正常H1-hESC样的形态特征(图3A)。而实时荧光定量PCR结果显示,H1-hESC来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系表达多能性基因OCT4、SOX2和NANOG的水平与野生型H1-hESC没有显著性差异(图3B)。同时,流式细胞分析术检测发现多能性蛋白Tra1-60、NANOG、OCT4的表达率均在90%以上(图4A)。免疫荧光染色检测胞内蛋白和表面蛋白也证实细胞可表达多能性蛋白NANOG、OCT4和SSEA4(图4B)。上述结果表明,已建立的H1-hESC来源的Runx1c-mNeonGreen报告细胞系仍然具有多能性。表2 不同类型的基因编辑效率Table 2 Different types of gene editing efficiency 电转细胞系 克隆数/个 基因编辑效率 总数 纯合基因型 杂合基因型 未编辑 H1-hESC 22 1 3 18 18.2%

表2 不同类型的基因编辑效率Table 2 Different types of gene editing efficiency 电转细胞系 克隆数/个 基因编辑效率 总数 纯合基因型 杂合基因型 未编辑 H1-hESC 22 1 3 18 18.2%图4 多能性蛋白检测


本文编号：3484593