小分子化合物Vc和RG108组合对山羊iPSC-like细胞多能性维持的研究
发布时间：2021-11-10 02:42
本研究利用山羊诱导多能干细胞（giPSCs-like）为实验材料,筛选能够促进giPSCs多能性状态维持的小分子化合物,从而优化培养体系。再对优化后的培养体系下获得的giPSCs进行一系列生物学特性检测,同时结合RNA-seq技术和生物信息学分析,探究其促进多能性维持的相关分子机制。1.促进山羊iPSC-like细胞多能性的培养条件筛选（1）通过比对添加单个作用于表观遗传的小分子药物对giPSC-like细胞的影响,以克隆形态,碱性磷酸酶活性以及相关基因的表达量作为鉴定指标,结果发现:Vc组与RG108组可以明显促进克隆的生长速度与维持克隆形态,克隆更加透亮,碱性磷酸酶（AP）活性增强。同时添加Vc组显著提高了组蛋白去甲基化酶KDM2B和DNA去甲基化酶TET1,TET3的表达。添加RG108组降低了 DNA甲基转移酶抑制剂（DNMT1）的表达。（2）进一步筛选小分子组合,结果发现:Vc与RG108（即VR）组合使用时,AP活性更强,同时显著上调TET1,TET3和显著下调DNMT1的表达。另外多能性基因OCT4,SOX2,NANOG的表达量也显著提高,促进多能性的维持。（3）筛选基础...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－２：撤ＤＯＸ时ｇｉＰＳＣ－２６传代后克隆形态变化
验单独添加５个小分子化合物，浓度设为文献报道工作浓度和２倍的工作浓度，??观察对克隆形态，碱性磷酸酶活性以及荧光定量ＰＣＲ结果的影响，发现：Ｖｃ组??与ＲＧ１０８组可以明显促进克隆的生长速度与维持克隆形态（图１－４），由图１－５??能看出ｂ，Ｃ两组ＡＰ着色最深，活性强，染色结果优于Ｃｏｎｔｒｏｌ组，与形态观察??结果一致，因此确定筛选小分子为Ｖｃ（５０?ｐＭ），ＲＧ１０８?（８?ｍＭ）。但是添加Ｖｃ提??高了组蛋白去甲基化酶ＫＤＭ２Ｂ和ＤＮＡ去甲基化酶ＴＥＴ１，ＴＥＴ３的表达，ＯＣＴ４??表达量显著提高，ＮＡＮＯＧ表达量提高不显著；添加ＲＧ１０８组降低了?ＤＮＡ甲基??２６??
细胞系多能性後持的研究??转移酶抑制剂（ＤＮＭＴ１）的表达，０ＣＴ４表达量提高不显著，但是ＮＡＮＯＧ表??达量得到显著提高（如图１－６）。其中ＲＧ１０８组工作浓度为８?ｐＭ，效果优于文献??报道的４?｜ｉＭ，?Ｖｃ设为文献报道工作浓度（即５０?ｐＭ）效果较好。??ｂ?艮?ｅ?Ｅ??ＭＢ??心ｔ…??阁１－４：作用表观遗传的小分子筛选时，克隆形态图（１０ｘ）。Ｃｏｎｔｒｏｌ为ＧＩＰＳ培养下的克??隆形态，其他图均是在ＧＩＰＳ基础上添加单个小分子的培养基体系下的克隆形态。ａ：添加??ＶＰＡ?（０．５ｍＭ），?Ａ：添加?ＶＰＡ（１?ｍＭ＞。ｂ：添加?Ｖｃ（５０（ｉＭ），?Ｂ：添加?Ｖｃ（１０〇ｈＭ）？?ｃ：添加??ＲＧ１０８（４ｐＭ），Ｃ：添力口?ＲＧ１０８（８｜ｉＭ）。?ｄ：添力口?３’Ｄｚｎｅｐ（０．１ｊａＭ）．Ｄ：添力口?３，Ｄｚｎｅｐ（０．２??ＨＭ）〇?ｅ：添加５－ａｚａ（０．５?ｐＭ），?Ｅ：添加５－ａｚａ（ｌ?ｐＭ）。由图能看出图ｂ，?Ｂ，?Ｃ克隆形态最??好，但是Ｂ组增殖过快，易分化，所以先排除。标尺＝１００?ｐｍ。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４：?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｃｌｏｎｅｓ?ｗｈｅｎ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｆｏｒ?ｓｍａｌｌ?ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ?ｔｈａｔ?ａｒｅ?ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ．?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ｉｓ?ａ?ｃｌｏｎｅｄ?ｆｏｒｍ?ｕｎｄｅｒ?ＧＩＰＳ?ｃｕｌｔｕｒｅ
【参考文献】：
期刊论文
[1]整合素和E-钙黏素在诱导多能干细胞重编程及干性维持中的作用[J]. 胡若文,陈晓芳. 中国组织工程研究. 2018(29)
[2]Hippo/YAP信号通路与细胞增殖相关信号通路交叉作用的研究进展[J]. 王琪,陈希彦,文勇. 国际口腔医学杂志. 2017(05)
[3]调控人类多能干细胞命运决定信号通路研究新进展[J]. 赵瀚知,金颖. 生命的化学. 2016(06)
[4]诱导重编程过程中的表观遗传重塑[J]. 陈珺,高亚威,陈嘉瑜,高绍荣. 生物化学与生物物理进展. 2015(11)
[5]转录组学技术在水产动物研究中的运用[J]. 罗辉,叶华,肖世俊,郑曙明,王晓清,王志勇. 水产学报. 2015(04)
[6]维生素C与表观遗传调控[J]. 郭琳,陈捷凯,裴端卿. 科学通报. 2014(Z2)
[7]转录组与RNA-Seq技术[J]. 张春兰,秦孜娟,王桂芝,纪志宾,王建民. 生物技术通报. 2012(12)
[8]转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J]. 祁云霞,刘永斌,荣威恒. 遗传. 2011(11)
[9]Wnt家族基因敲除小鼠胚胎发育异常的研究现状[J]. 李珊珊,肖晶. 大连医科大学学报. 2008(06)
硕士论文
[1]Wnt3a蛋白对小鼠胚胎干细胞多能性维持以及诱导多能干细胞重编程效率的影响[D]. 李少杰.内蒙古大学 2016
[2]小分子化合物诱导小鼠多能干细胞（CiPSCs）的研究[D]. 张俊.广西大学 2016
[3]利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究[D]. 邱峰龙.扬州大学 2014
[4]RG108对水牛成纤维细胞甲基化水平及其核移植胚胎发育的影响[D]. 蒙丽娜.广西大学 2012
[5]小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用[D]. 孟书燕.西北农林科技大学 2011
本文编号：3486409
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－２：撤ＤＯＸ时ｇｉＰＳＣ－２６传代后克隆形态变化
验单独添加５个小分子化合物，浓度设为文献报道工作浓度和２倍的工作浓度，??观察对克隆形态，碱性磷酸酶活性以及荧光定量ＰＣＲ结果的影响，发现：Ｖｃ组??与ＲＧ１０８组可以明显促进克隆的生长速度与维持克隆形态（图１－４），由图１－５??能看出ｂ，Ｃ两组ＡＰ着色最深，活性强，染色结果优于Ｃｏｎｔｒｏｌ组，与形态观察??结果一致，因此确定筛选小分子为Ｖｃ（５０?ｐＭ），ＲＧ１０８?（８?ｍＭ）。但是添加Ｖｃ提??高了组蛋白去甲基化酶ＫＤＭ２Ｂ和ＤＮＡ去甲基化酶ＴＥＴ１，ＴＥＴ３的表达，ＯＣＴ４??表达量显著提高，ＮＡＮＯＧ表达量提高不显著；添加ＲＧ１０８组降低了?ＤＮＡ甲基??２６??
细胞系多能性後持的研究??转移酶抑制剂（ＤＮＭＴ１）的表达，０ＣＴ４表达量提高不显著，但是ＮＡＮＯＧ表??达量得到显著提高（如图１－６）。其中ＲＧ１０８组工作浓度为８?ｐＭ，效果优于文献??报道的４?｜ｉＭ，?Ｖｃ设为文献报道工作浓度（即５０?ｐＭ）效果较好。??ｂ?艮?ｅ?Ｅ??ＭＢ??心ｔ…??阁１－４：作用表观遗传的小分子筛选时，克隆形态图（１０ｘ）。Ｃｏｎｔｒｏｌ为ＧＩＰＳ培养下的克??隆形态，其他图均是在ＧＩＰＳ基础上添加单个小分子的培养基体系下的克隆形态。ａ：添加??ＶＰＡ?（０．５ｍＭ），?Ａ：添加?ＶＰＡ（１?ｍＭ＞。ｂ：添加?Ｖｃ（５０（ｉＭ），?Ｂ：添加?Ｖｃ（１０〇ｈＭ）？?ｃ：添加??ＲＧ１０８（４ｐＭ），Ｃ：添力口?ＲＧ１０８（８｜ｉＭ）。?ｄ：添力口?３’Ｄｚｎｅｐ（０．１ｊａＭ）．Ｄ：添力口?３，Ｄｚｎｅｐ（０．２??ＨＭ）〇?ｅ：添加５－ａｚａ（０．５?ｐＭ），?Ｅ：添加５－ａｚａ（ｌ?ｐＭ）。由图能看出图ｂ，?Ｂ，?Ｃ克隆形态最??好，但是Ｂ组增殖过快，易分化，所以先排除。标尺＝１００?ｐｍ。??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４：?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｃｌｏｎｅｓ?ｗｈｅｎ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｆｏｒ?ｓｍａｌｌ?ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ?ｔｈａｔ?ａｒｅ?ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ．?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ｉｓ?ａ?ｃｌｏｎｅｄ?ｆｏｒｍ?ｕｎｄｅｒ?ＧＩＰＳ?ｃｕｌｔｕｒｅ
【参考文献】：
期刊论文
[1]整合素和E-钙黏素在诱导多能干细胞重编程及干性维持中的作用[J]. 胡若文,陈晓芳. 中国组织工程研究. 2018(29)
[2]Hippo/YAP信号通路与细胞增殖相关信号通路交叉作用的研究进展[J]. 王琪,陈希彦,文勇. 国际口腔医学杂志. 2017(05)
[3]调控人类多能干细胞命运决定信号通路研究新进展[J]. 赵瀚知,金颖. 生命的化学. 2016(06)
[4]诱导重编程过程中的表观遗传重塑[J]. 陈珺,高亚威,陈嘉瑜,高绍荣. 生物化学与生物物理进展. 2015(11)
[5]转录组学技术在水产动物研究中的运用[J]. 罗辉,叶华,肖世俊,郑曙明,王晓清,王志勇. 水产学报. 2015(04)
[6]维生素C与表观遗传调控[J]. 郭琳,陈捷凯,裴端卿. 科学通报. 2014(Z2)
[7]转录组与RNA-Seq技术[J]. 张春兰,秦孜娟,王桂芝,纪志宾,王建民. 生物技术通报. 2012(12)
[8]转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J]. 祁云霞,刘永斌,荣威恒. 遗传. 2011(11)
[9]Wnt家族基因敲除小鼠胚胎发育异常的研究现状[J]. 李珊珊,肖晶. 大连医科大学学报. 2008(06)
硕士论文
[1]Wnt3a蛋白对小鼠胚胎干细胞多能性维持以及诱导多能干细胞重编程效率的影响[D]. 李少杰.内蒙古大学 2016
[2]小分子化合物诱导小鼠多能干细胞（CiPSCs）的研究[D]. 张俊.广西大学 2016
[3]利用特定转录因子的mRNA诱导获得山羊iPS细胞的研究[D]. 邱峰龙.扬州大学 2014
[4]RG108对水牛成纤维细胞甲基化水平及其核移植胚胎发育的影响[D]. 蒙丽娜.广西大学 2012
[5]小分子化合物在诱导山羊iPS细胞中的作用[D]. 孟书燕.西北农林科技大学 2011
本文编号：3486409
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