SKL通过促进内皮细胞黏附增强小口径人工血管通畅和内皮化

发布时间：2022-08-06 18:07

　　目的:本研究致力于构建组织工程生物活性小血管。首先用猪脱细胞的小肠粘膜下层（Small intestinal submucosa,SIS）交联肝素与分泌型Klotho（Secreted Klotho,SKL）,再人工缝制成管状小血管,移植入新西兰大白兔模型中,替代一部分自体颈动脉血管。分别于术后2、3个月后取材,通过蛋白免疫印迹法（Western Blot）,组织学染色,免疫荧光等实验技术手段,观察颈动脉管壁的变化与内皮化等相关指标的表达情况,以探讨SKL修饰的人工血管在替代受损血管中发挥的作用,以及内皮化的情况,为构建组织工程化小血管提供实验基础。方法:1.体外条件下培养HEK293细胞,将其分为两组,N组和SKL组。N组为正常组,转染空载体。SKL组转染带有SKL基因的质粒。用Western Blot技术分别对转染后的培养基及细胞中的SKL蛋白进行检测分析。收集转染之后的HEK293细胞的无血清培养基,用蛋白纯化镍柱对SKL蛋白进行提取与纯化。2.体外:将肝素和纯化后的SKL蛋白交联到脱细胞SIS膜上,分为SIS膜,SIS膜+肝素,SIS膜+肝素+SKL三组,将人脐静脉内皮细胞（H... 

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
1 前言
2 材料和方法
    2.1 实验动物
    2.2 试剂与仪器
        2.2.1 主要试剂
        2.2.2 主要仪器
    2.3 实验方法
        2.3.1 HEK293 细胞的培养与过表达SKL的 HEK293 细胞的构建
        2.3.2 SKL蛋白的纯化与鉴定
        2.3.3 SKL对 HUVECs中 p-FAK,FAK,RHOA的表达调控
        2.3.4 脱细胞SIS的制备
        2.3.5 SIS的力学性能测试
        2.3.6 肝素化SIS、以及交联SKL的肝素化SIS的制备
        2.3.7 体外HUVECs与 SIS复合培养-电镜
        2.3.8 体外HUVECs与 SIS复合培养-CCK-8
        2.3.9 体外HUVECs与 SIS复合培养-免疫荧光
        2.3.10 人工血管的缝制与动物模型的建立
        2.3.11 兔血接触实验
        2.3.12 多普勒超声
        2.3.13 动物模型取材及人工血管测量
        2.3.14 人工血管管腔的扫描电镜观察
        2.3.15 石蜡包埋与切片
        2.3.16 苏木精-伊红(HE)染色
        2.3.17 Masson染色
        2.3.18 OCT包埋与冰冻切片
        2.3.19 免疫荧光染色
    2.4 统计学分析方法
3 实验结果
    3.1 HEK293 细胞的培养与过表达Klotho的 HEK293 的构建
    3.2 SKL蛋白的纯化与鉴定
    3.3 SKL上调p-FAK,FAK,RHOA在内皮细胞的表达
    3.4 SIS成功脱细胞
    3.5 SIS的力学性能良好
    3.6 SKL成功交联到SIS上
    3.7 体外HUVECs与 SIS复合培养-电镜
    3.8 体外HUVECs与 SIS复合培养-CCK-8
    3.9 体外HUVECs与 SIS复合培养-免疫荧光
    3.10 兔血接触实验
    3.11 多普勒超声
    3.12 人工血管取材
    3.13 人工血管管腔的扫描电镜观察
    3.14 苏木精-伊红(HE)染色观察人工血管管径及组织重构
    3.15 Masson染色观察
    3.16 免疫荧光显示SKL修饰的人工血管内皮更完整
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]表面纳米仿生改性的组织工程血管支架材料对猪血液相容性的影响[J]. 韩本松,范存义,刘生和.  中华医学杂志. 2006(29)



本文编号：3670117