HAP/β-TCP/CS、KGM/HA骨组织工程支架材料的制备及临床前期研究
发布时间：2022-10-10 20:52
生物支架材料作为骨损伤治疗的载体,加载种子细胞后形成细胞复合材料,移植到骨损伤部位,通过种子细胞不断增殖以及分泌因子等作用,诱使种子细胞向成骨细胞分化,同时生物材料在体内生物降解,从而达到修复骨损伤的目的。骨损伤治疗中,种子细胞和载体材料是研究的热点和难点,干细胞具有自我更新和分化特性,已逐渐成为修复和治疗包括骨损伤、系统性红斑狼疮、贫血等病理性病变和生理性退变的重要手段,临床应用的主要问题是来源受限；骨损伤治疗中支架材料应具有无毒、适宜的力学支架结构、可稳定持续完全降解、良好的生物相容性等,目前已知单一材料很难达到这种要求,本研究以魔芋葡甘聚糖（Konjac glucomannan, KGM）、透明质酸（Hyaluronic acid, HA）、羟基磷灰石（Hydroxyapatite, HAP）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）以及壳聚糖（Chitosan, CS）为原料制备的复合材料满足骨组织工程的要求。因此,以复合支架材料为载体,加载干细胞治疗骨损伤,探讨细胞复合材料对骨损伤的修复和治疗作用,具体研究内容及结果如下： 1. KGM/...
【文章页数】：138 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第一章 绪论
1.1 生物支架材料
1.1.1 生物支架材料分类
1.1.2 生物材料支架制备工艺
1.1.3 生物支架特征
1.2 种子细胞
1.2.1 成骨细胞
1.2.2 骨髓基质细胞
1.2.3 基因修饰细胞
1.2.4 干细胞
1.2.5 种子细胞存在的问题及展望
1.3 生物活性因子
1.3.1 成纤维细胞生长因子
1.3.2 胰岛素样生长因子
1.3.3 血小板衍生生长因子
1.3.4 转化生长因子β
1.3.5 骨形态发生蛋白
1.3.6 血管内皮生长因子
1.4 本课题研究的目的和意义
第二章 生物材料的制备
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 HAP/β-TCP/CS多孔支架材料制备技术路线
2.2.2 KGM/HA多孔支架材料制备技术路线
2.2.3 HAP/β-TCP/CS多孔支架材料的制备方法
2.2.4 KGM/HA多孔支架材料的制备方法
2.2.5 支架孔径分析方法
2.2.6 支架抗压强度分析方法
2.2.7 支架吸水率分析方法
2.2.8 扫描电镜(SEM)分析
2.2.9 支架体外降解性能分析
2.3 结果与讨论
2.3.1 HAP/β-TCP/CS多孔支架材料
2.3.2 KGM/HA多孔支架材料
2.4 小结
第三章 诱导多能干细胞的制备和鉴定
3.1 实验材料
3.1.1 主要试剂
3.1.2 试剂配制方法
3.1.3 主要仪器
3.1.4 实验动物
3.1.5 成纤维细胞来源
3.1.6 天然诱导剂制备
3.2 实验方法
3.2.1 诱导多能干细胞的制备和鉴定实验方案
3.2.2 成纤维细胞的制备
3.2.3 蛋白标准曲线的绘制
3.2.4 改良MTT法检测鱼卵提取物对成纤维细胞增殖的影响
3.2.5 人成纤维细胞的诱导
3.2.6 免疫细胞化学检测方法
3.2.7 半定量PCR检测基因表达量
3.2.8 组织切片制作方法
3.2.9 体内分化致瘤实验
3.2.10 DNA甲基化修饰分析(BSP法)
3.2.11 实时荧光定量PCR分析
3.2.12 透射电镜切片制作
3.2.13 重编程细胞体外成骨分化诱导
3.2.14 重编程细胞体外成脂分化诱导
3.2.15 重编程细胞体外成神经细胞分化诱导
3.2.16 Western Blot分析
3.2.17 数据统计分析
3.3 结果
3.3.1 蛋白测定标准曲线
3.3.2 成纤维细胞的纯度鉴定
3.3.3 成纤维细胞的形态学
3.3.4 鱼卵提取物对成纤维细胞增殖的影响
3.3.5 诱导细胞形态学特征与干细胞标志性基因表达分析
3.3.6 畸胎瘤的组织结构
3.3.7 多潜能基因启动子区域甲基化分析
3.3.8 实时荧光定量PCR结果
3.3.9 信号通路关键蛋白磷酸化结果
3.3.10 重编程细胞体外分化潜能
3.3.11 亚细胞结构分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 细胞-支架复合材料的生物相容性及对骨损伤的治疗和修复作用
4.1 实验材料
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 细胞-支架生物相容性及骨损伤治疗研究总体方案
4.2.2 iMS细胞的制备
4.2.3 生物支架材料浸提液的制备
4.2.4 细胞毒性实验
4.2.5 组织切片的制作步骤
4.2.6 细胞-支架复合材料的制备方法
4.2.7 狗桡骨缺损动物模型及移植方法
4.2.8 兔桡骨缺损动物模型及移植方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 iMS细胞-HAP/β-TCP/CS复合材料的生物相容性及骨损伤修复结果
4.3.2 iMS细胞-KGM/HA复合材料的生物相容性及骨损伤修复结果
4.4 小结
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 问题及展望
致谢
参考文献
附录
附录A 攻读博士学位期间发表的论文及成果
附录B 相关图表
【参考文献】：
期刊论文
[1]魔芋葡甘聚糖的改性及其在生物材料领域的应用概况[J]. 许东颖,盛家荣,李光吉. 材料导报. 2008(11)
[2]壳聚糖基因纳米粒子的细胞摄入和体外毒性研究[J]. 张海玲,王芹,宋丽萍,岳井银,冷希岗. 生物医学工程学杂志. 2007(06)
[3]魔芋葡甘聚糖结构改性及其生物学特性在组织工程复合材料中的作用[J]. 景森,张峰,陈庆华,潘兴华,庞荣清. 中国组织工程研究与临床康复. 2007(35)
[4]Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency[J]. James A Thomson. Cell Research. 2007(01)
[5]软骨组织工程支架材料研究的现状[J]. 李强,孙正义. 中国组织工程研究与临床康复. 2007(01)
[6]骨组织工程种子细胞的研究近况[J]. 王萍,邹霓. 中国临床康复. 2006(41)
[7]磷酸钙生物材料固有骨诱导性的研究现状与展望[J]. 包崇云,张兴栋. 生物医学工程学杂志. 2006(02)
[8]Identification of two distinct transactivation domains in the pluripotency sustaining factor nanog[J]. GUANG Jin PAN, DUAN QING PEI Institute of Pharmacology, Department of Biological Sciences and Biotechnology and State Key Labora tory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Tsinghua Institutes of Biomedicine, Tsinghua University, 100084 Beijing, China. E-mail: duanqing@aol.com Department of Pharmacology, University of Minnesota, Minneapolis, MN55455, USA. Cell Research. 2003(06)
[9]HA/TCP双相陶瓷肌内长期植入诱导成骨的实验观察[J]. 卢晓风,卢冰,张杰,张真,李胜富,步宏,李幼平,程惊秋. 生物医学工程学杂志. 2002(03)
本文编号：3690332
【文章页数】：138 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第一章 绪论
1.1 生物支架材料
1.1.1 生物支架材料分类
1.1.2 生物材料支架制备工艺
1.1.3 生物支架特征
1.2 种子细胞
1.2.1 成骨细胞
1.2.2 骨髓基质细胞
1.2.3 基因修饰细胞
1.2.4 干细胞
1.2.5 种子细胞存在的问题及展望
1.3 生物活性因子
1.3.1 成纤维细胞生长因子
1.3.2 胰岛素样生长因子
1.3.3 血小板衍生生长因子
1.3.4 转化生长因子β
1.3.5 骨形态发生蛋白
1.3.6 血管内皮生长因子
1.4 本课题研究的目的和意义
第二章 生物材料的制备
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.2.1 HAP/β-TCP/CS多孔支架材料制备技术路线
2.2.2 KGM/HA多孔支架材料制备技术路线
2.2.3 HAP/β-TCP/CS多孔支架材料的制备方法
2.2.4 KGM/HA多孔支架材料的制备方法
2.2.5 支架孔径分析方法
2.2.6 支架抗压强度分析方法
2.2.7 支架吸水率分析方法
2.2.8 扫描电镜(SEM)分析
2.2.9 支架体外降解性能分析
2.3 结果与讨论
2.3.1 HAP/β-TCP/CS多孔支架材料
2.3.2 KGM/HA多孔支架材料
2.4 小结
第三章 诱导多能干细胞的制备和鉴定
3.1 实验材料
3.1.1 主要试剂
3.1.2 试剂配制方法
3.1.3 主要仪器
3.1.4 实验动物
3.1.5 成纤维细胞来源
3.1.6 天然诱导剂制备
3.2 实验方法
3.2.1 诱导多能干细胞的制备和鉴定实验方案
3.2.2 成纤维细胞的制备
3.2.3 蛋白标准曲线的绘制
3.2.4 改良MTT法检测鱼卵提取物对成纤维细胞增殖的影响
3.2.5 人成纤维细胞的诱导
3.2.6 免疫细胞化学检测方法
3.2.7 半定量PCR检测基因表达量
3.2.8 组织切片制作方法
3.2.9 体内分化致瘤实验
3.2.10 DNA甲基化修饰分析(BSP法)
3.2.11 实时荧光定量PCR分析
3.2.12 透射电镜切片制作
3.2.13 重编程细胞体外成骨分化诱导
3.2.14 重编程细胞体外成脂分化诱导
3.2.15 重编程细胞体外成神经细胞分化诱导
3.2.16 Western Blot分析
3.2.17 数据统计分析
3.3 结果
3.3.1 蛋白测定标准曲线
3.3.2 成纤维细胞的纯度鉴定
3.3.3 成纤维细胞的形态学
3.3.4 鱼卵提取物对成纤维细胞增殖的影响
3.3.5 诱导细胞形态学特征与干细胞标志性基因表达分析
3.3.6 畸胎瘤的组织结构
3.3.7 多潜能基因启动子区域甲基化分析
3.3.8 实时荧光定量PCR结果
3.3.9 信号通路关键蛋白磷酸化结果
3.3.10 重编程细胞体外分化潜能
3.3.11 亚细胞结构分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 细胞-支架复合材料的生物相容性及对骨损伤的治疗和修复作用
4.1 实验材料
4.1.1 主要试剂
4.1.2 主要仪器
4.2 实验方法
4.2.1 细胞-支架生物相容性及骨损伤治疗研究总体方案
4.2.2 iMS细胞的制备
4.2.3 生物支架材料浸提液的制备
4.2.4 细胞毒性实验
4.2.5 组织切片的制作步骤
4.2.6 细胞-支架复合材料的制备方法
4.2.7 狗桡骨缺损动物模型及移植方法
4.2.8 兔桡骨缺损动物模型及移植方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 iMS细胞-HAP/β-TCP/CS复合材料的生物相容性及骨损伤修复结果
4.3.2 iMS细胞-KGM/HA复合材料的生物相容性及骨损伤修复结果
4.4 小结
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 创新点
5.3 问题及展望
致谢
参考文献
附录
附录A 攻读博士学位期间发表的论文及成果
附录B 相关图表
【参考文献】：
期刊论文
[1]魔芋葡甘聚糖的改性及其在生物材料领域的应用概况[J]. 许东颖,盛家荣,李光吉. 材料导报. 2008(11)
[2]壳聚糖基因纳米粒子的细胞摄入和体外毒性研究[J]. 张海玲,王芹,宋丽萍,岳井银,冷希岗. 生物医学工程学杂志. 2007(06)
[3]魔芋葡甘聚糖结构改性及其生物学特性在组织工程复合材料中的作用[J]. 景森,张峰,陈庆华,潘兴华,庞荣清. 中国组织工程研究与临床康复. 2007(35)
[4]Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency[J]. James A Thomson. Cell Research. 2007(01)
[5]软骨组织工程支架材料研究的现状[J]. 李强,孙正义. 中国组织工程研究与临床康复. 2007(01)
[6]骨组织工程种子细胞的研究近况[J]. 王萍,邹霓. 中国临床康复. 2006(41)
[7]磷酸钙生物材料固有骨诱导性的研究现状与展望[J]. 包崇云,张兴栋. 生物医学工程学杂志. 2006(02)
[8]Identification of two distinct transactivation domains in the pluripotency sustaining factor nanog[J]. GUANG Jin PAN, DUAN QING PEI Institute of Pharmacology, Department of Biological Sciences and Biotechnology and State Key Labora tory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Tsinghua Institutes of Biomedicine, Tsinghua University, 100084 Beijing, China. E-mail: duanqing@aol.com Department of Pharmacology, University of Minnesota, Minneapolis, MN55455, USA. Cell Research. 2003(06)
[9]HA/TCP双相陶瓷肌内长期植入诱导成骨的实验观察[J]. 卢晓风,卢冰,张杰,张真,李胜富,步宏,李幼平,程惊秋. 生物医学工程学杂志. 2002(03)
本文编号：3690332
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