TAZ和YAP介导支架表面形貌调控骨髓间充质细胞的成骨分化

发布时间：2017-05-16 03:10

  本文关键词：TAZ和YAP介导支架表面形貌调控骨髓间充质细胞的成骨分化，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 近年来,虽然干细胞的相关研究已经在医学生物领域显示出了广阔的应用前景,但是仍然面临着许多挑战。其中组织工程生物材料是迫切需要解决的问题之一。组织工程包括三大要素：支架材料、种子细胞和生长因子,其中起着中心作用的是支架材料。它除了为特定的细胞提供结构支撑外,其立体微观的表面形貌能调节细胞的黏附、伸展和基因表达,诱导组织再生和控制组织结构,在组织工程中起着至关重要的作用。同时,信号通路对细胞的生长过程同样起着及其重要的作用。近年来,发现Hippo信号是细胞增殖、分化和凋亡控制的重要信号通路。已有研究表明,Hippo信号TAZ/YAP是人类和小鼠胚胎干细胞多能性维持的必要分子,也是干细胞增殖的重要调控因子。虽然一些研究已经揭示了细胞在微观表面形貌上的行为,但对于细胞感应、细胞间信号传导或细胞对表面形貌的长期反应性机制,人们依然不甚清楚。 目的： 本项目拟通过在体外细胞模型上研究Hippo信号关键因子TAZ和YAP介导的支架表面微米形貌调控干细胞增殖、分化的效应及机制,以及基于Hippo信号关键因子TAZ和YAP促进普通培养的BMSC增殖和成骨分化的效应及机制等的研究,明确支架表面微米形貌调控间充质干细胞增殖和成骨分化、调控Hippo信号的效应和机制,以及微米形貌通过Hippo信号关键因子TAZ和YAP调控间充质干细胞增殖和成骨分化的意义。本项目研究能深化对支架表面微米形貌调控细胞分化机制的理解,为设计更为安全有效的骨组织工程支架材料提供理论依据和实验依据。 方法： 1.羟基磷灰石支架的构建 Ca3(PO4)2和CaCO3定比例在高温下反应同时注入高压水蒸气,粉末经NH4Cl水溶液洗涤后干燥而成,成型后于1250℃烧结而成。 2.表面形貌的打磨羟基磷灰石支架构建完成后,用不同规格的砂纸做表面打磨(P180,P240,P600, P800, P1200, P2000),对应的颗粒直径分别为82μm,58.5μm,25.8μm,21.8μm,15.3μm,10.3μm。 3.表面粗糙度的测量用表面粗糙度测量仪来检测表面面粗糙度参数：微观不平度高度特性有关的表面粗糙度—轮廓算术平均偏差Ra和微观不平度间距特性有关的表面粗糙度—轮廓微观不平度的平均间距Sm。扫描电镜观察表面打磨形貌。 4.表面粗糙度对骨髓间充质干细胞增殖的影响将骨髓间充质干细胞以5*10＾4/scaffold接种,分别于接种后12h,24h,36h,48h,60h,72h,84h,96h使用Alamar Blue试剂检测细胞的增殖情况。 5.表面粗糙度对骨髓间充质干细胞分化的影响将骨髓间充质干细胞以5*10＾4/scaffold接种后,成骨诱导2天、7天后检测成骨相关基因的表达；成骨诱导7天后做碱性磷酸酶染色；成骨诱导28天后,做茜素红矿化染色。 6.表面粗糙度对骨髓间充质干细胞行为产生影响的分子机制将骨髓间充质干细胞种植在羟基磷灰石支架表面,经过2天的成骨诱导后,检测成骨相关基因的表达、Hippo信号关键因子TAZ和YAP的表达以及敲除TAZ和YAP后,骨髓间充质干细胞在支架表面成骨的分化,。包括ALP染色,茜素红染色和成骨相关基因RT-PCR。 结果： 1.打磨后的羟基磷灰石支架表面扫描电镜观察,可见不同粗细以及深度的打磨痕迹。表面粗糙度扫描可见与微观不平度高度特性有关的表面粗糙度—轮廓算术平均偏差Ra以及与微观不平度间距特性有关的表面粗糙度—轮廓微观不平度的平均间距Sm,均显示出了与打磨颗粒直径一致的变化。2.骨髓间充质干细胞在打磨后的材料表面显示出了比未打磨的材料上更强的增殖能力。3.碱性磷酸酶染色和茜素红矿化染色显示：打磨后的粗糙表面显著增强了骨髓间充质干细胞的成骨能力。4.羟基磷灰石支架微米级粗糙表面形貌显著增加了骨髓间充质干细胞的成骨基因表达,且显著增加细胞内Hippo信号关键因子YAP和TAZ的水平。慢病毒敲除TAZ和YAP之后,骨髓间充质干细胞在微米级粗糙度表面的成骨能力和未打磨的光滑羟基磷灰石支架表面未见显著差异。 结论：本研究中我们设计了羟基磷灰石支架,并用不同规格的砂纸做了表面粗糙度的打磨,骨髓间充质干细胞接种于材料表面,在粗糙的材料表面显现出更强的增殖和成骨分化能力,直接证明了表面形貌对于间充质干细胞行为的影响。骨髓间充质干细胞种植在表面打磨的羟基磷灰石支架上,表面粗糙度促进了间充质干细胞的成骨分化,同时上调了Hippo信号关键因子TAZ和YAP的表达水平,且TAZ和YAP的表达水平和成骨相关基因的表达水平呈现出相同的趋势。在敲除TAZ和YAP后骨髓间充质干细胞在微米级粗糙度表面的成骨能力和未打磨的光滑羟基磷灰石支架表面未见显著差异,证明表面形貌调控骨髓间充质细胞向成骨细胞分化,是通过TAZ和YAP起作用的。本项目的研究,能深化对支架表面微米形貌调控细胞分化机制的理解,为设计更为安全有效的骨组织工程支架材料提供理论依据和实验依据。
【关键词】：支架材料 Hippo信号 骨髓间充质干细胞 成骨细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R687;R318.08
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-9
• Abstract9-14
• 缩略词表14-16
• 1 引言16-20
• 2 资料方法与结果20-38
• 2.1 材料20
• 2.2 表面粗梭度的检测20-22
• 2.3 hBMSC的分离纯化22-23
• 2.4 hBMSC的在不同粗糙度材料表面的增殖23-25
• 2 5 hBMSC的在不同粗糙度材料表面的成骨分化25-30
• 2.6. hBMSC在不同粗糙度表面的成骨能力差异的机制——hippo信号关键因子TAZ和YAP30-38
• 3. 讨论38-42
• 4. 结论42-43
• 参考文献43-46
• 综述46-58
• 参考文献53-58
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果58

【共引文献】

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1 陈雪;分区式组织工程脊髓修复大鼠脊髓损伤与抑制神经组织的细胞凋亡研究[D];苏州大学;2014年

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本文编号：369447