基于3D打印技术的新型电纺聚偏二氟乙烯材质补片体外细胞毒性研究

发布时间：2017-05-16 17:13

  本文关键词：基于3D打印技术的新型电纺聚偏二氟乙烯材质补片体外细胞毒性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 1.评价基于3D打印技术的电纺工艺制成的聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）材质盆底补片对小鼠成纤维细胞(L929细胞）的细胞毒性，并与聚丙烯（polypropylene，PP）网片的细胞毒性进行比较。 2.建立从人阴道壁组织分离人阴道上皮细胞(hunman vaginal epithelial cells，hVECs)及其体外培养方法，并对其体外生物学特性进行研究。用hVECs对电纺丝工艺制成的PVDF材质盆底补片的细胞毒性进行研究。 材料与方法 1.依据ISO10993的评价标准采用L929细胞进行电纺PVDF材质补片的细胞毒性研究。实验分为A组（空白对照组，完全培养基），B组（乳胶手套浸提液,阳性对照组），C组（聚丙烯材料浸提液,阴性对照组），D组（PVDF材料浸提液组）4组。(1)评价细胞形态学及代谢特性：用四组材料浸提液分别培养L929细胞24h、48h、72h，倒置相差显微镜观察L929细胞形态；四唑化合物MTS比色法测定各组吸光度值，并计算相对增值率（relative growth rate，RGR）进行毒性分级。(2)评价细胞凋亡：用A组、B组、C组、D组培养基培养L929细胞72h后，通过检测细胞凋亡获得各组正常细胞及晚期凋亡、坏死细胞比率。(3)评价细胞相容性：将L929细胞种植于PVDF膜片上，扫描电镜观察培养1天、3天、7天时L929细胞生长情况。 2.取因盆腔器官脱垂行阴道前后壁修补患者的阴道前壁组织，II型中性蛋白酶4℃过夜消化阴道组织后分离上皮层和固有层，上皮层用胰酶进一步消化成细胞悬液接种到角化细胞无血清培养基（K-SFM）。显微镜下观察hVECs形态及增值特征；取第1代hVECs测定细胞生长曲线；通过角蛋白免疫染色对hVECs进行鉴定。依据ISO10993的评价标准进行电纺PVDF补片对VECs细胞毒性的实验。显微镜观察hVECs与四组材料浸提液共培养24h、48h、72h各时相点的形态学变化；MTS比色法检测四组吸光度值，据此计算RGR并进行毒性分级。流式细胞仪测定A、B、C、D组细胞中正常存活细胞及晚期凋亡加坏死细胞所占百分比。将hVECs种植于PVDF膜片上，扫描电镜观察在第1天、第3天及第7天时细胞在材料上的生长情况。 结果 1.在24h、48h、72h三个时相点A组、C组、D组L929细胞形状、贴壁状态、及增殖情况基本一致，见细胞形态正常，呈梭形或不规则三角形，贴壁生长良好；B组见大量死细胞和细胞碎裂，细胞层几乎完全破坏，B组对L929细胞呈现重度毒性。通过MTS测定四组细胞在三个时间的吸光度：与A组细胞比较，C组、D组细胞毒性分级为0级和0~1级，B组细胞细胞毒性分级为4级；A、C、D组3组吸光度值两两进行比较，差异无统计学意义（P0.05），A、C、D组3组分别与B组吸光度值比较，差异均有统计学意义（P 0.05）。72h时各组细胞凋亡结果：A组、B组、C组及D组细胞存活细胞的比率分别（92.43±1.24）%、（3.66±0.25）%、（92.23±0.64）%和（92.8±0.89）%，晚期凋亡加坏死细胞比率为（4.32±1.14）%、（95.06±1.33）%、（3.57±1.15）%、（3.85±1.08）%，A、C、D组两两进行比较，，差异无统计学意义（P0.05），A、C、D组与B组比较，差异有统计学意义（P 0.05）。扫描电镜提示随着L929细胞在PVDF材料种植时间的延长，细胞逐渐增多并向材料的纤维空隙向深层张入。 2.原代阴道上皮细胞接种24h左右细胞开始贴壁，4天后细胞生长加快，一般原代细胞7~10天可完成传代。传代后hVECs24h可基本完成贴壁，5~7天可进行传代。hVECs呈多角形，形态大小均一，折光性较好。hVECs5代后逐渐老化。使用角蛋白免疫组织化学染色阳性。 3.在24h、48h、72h三个时相点A组、C组、D组阴道上皮细胞细胞形状、贴壁状态、及生长情况基本一致，见细胞大小均一，细胞呈多角形，贴壁生长良好；B组见大量死细胞和细胞碎裂，基本未见到贴壁细胞，细胞层完全破坏。通过MTS测定四组细胞在三个时间的吸光度：与A组细胞比较，C组、D组细胞毒性分级为1级及0~1级，B组细胞细胞毒性分级为4级；A、C、D组3组吸光度值组间比较无显著性差异，3组分别与B组吸光度比较差异有统计学意义（P 0.05）。流式细胞仪测定72h4组细胞凋亡情况提示：各组细胞存活细胞的比率分别为（78.73±3.00）%、（6.8±2.14）%、（76.57±5.86）%、（78.43±2.35）%，A、C、D组两两进行比较，差异无统计学意义（P0.05），A、C、D组与B组比较，差异有统计学意义（P 0.05）；晚期凋亡加坏死细胞分别为（3.36±1.38）%、（80.43±0.61）%、（7.8±0.61）%、（4.12±0.44）%，A、C、D组与B组比较差异有统计学意义，C组高于A组、D组，差异有统计学意义（P0.05）。扫描电镜提示随着细胞在PVDF材料种植时间的延长，细胞逐渐增多并向材料的纤维空隙向深层张入。 结论 1.中性蛋白酶II型可以完整的分离出阴道上皮层，两步酶消化法获得纯度较高的阴道上皮细胞。 2.PVDF材料对于L929细胞及hVECs无细胞毒性。 3.hVECs较L929细胞对盆底材料的毒性更加敏感性。
【关键词】：静电纺丝 聚偏二氟乙烯材料 L929细胞 人阴道上皮细胞 生物相容性 体外细胞毒性
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08;R711.5
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 目录10-11
• 中英文缩略词表11-12
• 前言12-16
• 1 人工合成补片在女性盆底功能障碍性疾病中的应用12-14
• 2 电纺PVDF材质补片的特点14-15
• 3 体外细胞毒性实验中的细胞15-16
• 第一章 PVDF 补片对 L929 细胞体外细胞毒性研究16-26
• 1 材料与方法16-20
• 2 结果20-23
• 3 讨论23-26
• 第二章 VECs 与聚偏二氟乙烯材质补片的体外细胞毒性研究26-37
• 1 材料与方法26-30
• 2 结果30-34
• 3 讨论34-37
• 全文结论37-38
• 参考文献38-42
• 附图42-43
• 在学期间发表论文43-44
• 致谢44

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 李亚兰;张晓红;王建六;魏丽惠;;补片在盆腔器官脱垂全盆底重建术中应用的初步临床分析[J];中国妇产科临床杂志;2008年02期

2 罗新;王晓玉;沈媛;蒋学风;李瑞满;帅翰林;马雪枫;谢静燕;李玉娟;;Prolift网片联合尿道中段悬吊治疗POP或合并SUI患者的近期疗效[J];现代妇产科进展;2009年04期

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5 陈登龙;李敏;房乾;;电纺丝技术在纳米结构高分子支架中的应用[J];中国修复重建外科杂志;2007年04期

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本文编号：371440