新型HRM技术在遗传病和药物基因组检测中的应用

发布时间：2023-03-19 05:05

　　背景:高分辨熔解曲线分析(HRM)技术是一种由熔解曲线技术为基础发展起来的核酸分析技术。由于该技术是一种操作简单、快速且成本低的核酸分析方法,HRM技术从其诞生伊始就受到了广泛的关注,基于HRM的新型检测方法也不断出现。Williams-Beuren综合征(WBS)是一种严重且较为常见的多系统缺陷综合征,7号染色体长臂7q11.23区域的杂合缺失被认为是该病的病因,相同区域的拷贝数重复也会造成多系统的发育异常。氯吡格雷是一种急性冠脉综合征和经皮冠状动脉介入术后常用药物,CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17、PON1 Q192R以及ABCB1 C3435T的基因多态性会导致患者出现氯吡格雷低应答现象。喹硫平与阿立哌唑是两种常用的第二代精神药物,其药效和副作用分别受到CYP1A2*1F、CYP3A5*3和CYP3A4*1G、ANKK1 Taq1A的影响。目的:利用dNTP限制性PCR和HRM技术联用,建立一种用于检测7q11.23区域微缺失/微重复的方法;利用5’GC碱基修饰的引物和多重HRM技术,建立一种用于检测氯吡格雷精准用药相关的5个SNP位点的方法;利用多色...

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 分子诊断常用技术
        1.1.1 染色体核型分析技术
        1.1.2 荧光原位杂交技术(FISH)
        1.1.3 基因芯片技术
        1.1.4 测序技术
        1.1.5 多重连接探针扩增(MLPA)技术
        1.1.6 基于PCR的分子诊断技术
    1.2 HRM技术简介
        1.2.1 HRM技术的原理
        1.2.2 饱和荧光染料
        1.2.3 HRM分析仪器
        1.2.4 HRM检测的数据分析
    1.3 HRM在医学领域的应用
        1.3.1 HRM在SNP分型中的应用
        1.3.2 HRM在序列匹配中的应用
        1.3.3 HRM在突变扫描中的应用
        1.3.4 HRM在甲基化检测中的应用
        1.3.5 HRM在微生物检测中的应用
        1.3.6 HRM在CNV检测中的应用
        1.3.7 HRM技术在串联重复序列分析中的应用
    1.4 HRM技术的分类
        1.4.1 短扩增子HRM技术
        1.4.2 多重HRM技术
        1.4.3 非标记探针和回弹探针HRM技术
        1.4.4 多色荧光探针HRM技术
    1.5 本论文研究目的、研究内容及创新性
        1.5.1 本论文研究目的
        1.5.2 研究内容
        1.5.3 创新性
第二章 基于HRM技术的7q11.23微缺失/微重复分析方法的建立
    2.1 前言
    2.2 目标基因的选择、引物设计与熔解曲线模拟
        2.2.1 实验部分
        2.2.2 结果
    2.3 引物特异性的验证
        2.3.1 实验部分
        2.3.2 结果
    2.4 dNTP浓度的优化
        2.4.1 实验部分
        2.4.2 结果
    2.5 dNTP浓度的确定
        2.5.1 实验部分
        2.5.2 结果
    2.6 临床标本检测
        2.6.1 实验部分
        2.6.2 结果
    2.7 基因芯片实验验证HRM检测结果
        2.7.1 实验部分
        2.7.2 结果
    2.8 HRM检测方法的重复性验证
        2.8.1 实验部分
        2.8.2 结果
    2.9 标本添加量对HRM检测的影响
        2.9.1 实验部分
        2.9.2 结果
    2.10 讨论
    2.11 本章小结
第三章 基于多重HRM的氯吡格雷耐药基因SNP位点检测方法的建立
    3.1 前言
    3.2 目标SNP位点的引物设计与HRM曲线模拟
        3.2.1 实验部分
        3.2.2 结果
    3.3 引物特异性的验证
        3.3.1 实验部分
        3.3.2 结果
    3.4 针对氯吡格雷耐药基因的单重HRM检测方法的建立
        3.4.1 实验部分
        3.4.2 结果
    3.5 单重HRM检测方法的临床标本检测
        3.5.1 实验部分
        3.5.2 结果
    3.6 单重HRM临床标本检测结果的Sanger测序验证
        3.6.1 实验部分
        3.6.2 结果
    3.7 多重HRM检测方法的建立
        3.7.1 实验部分
        3.7.2 结果
    3.8 多重HRM实验结果的Sanger测序验证
        3.8.1 实验部分
        3.8.2 结果
    3.9 多重HRM检测方法的重复性验证
        3.9.1 实验部分
        3.9.2 结果
    3.10 标本添加量对多重HRM检测结果的影响
        3.10.1 实验部分
        3.10.2 结果
    3.11 讨论
    3.12 本章小结
第四章 基于多色探针HRM技术的喹硫平和阿立哌唑药物代谢基因位点检测方法的建立
    4.1 前言
    4.2 目标SNP位点的引物及分子信标设计与分子信标二级结构模拟
        4.2.1 实验部分
        4.2.2 结果
    4.3 引物特异性的验证
        4.3.1 实验部分
        4.3.2 结果
    4.4 单色探针HRM方法的建立
        4.4.1 实验部分
        4.4.2 结果
    4.5 多色探针HRM方法的建立
        4.5.1 实验部分
        4.5.2 结果
    4.6 多色探针HRM的临床标本检测
        4.6.1 实验部分
        4.6.2 结果
    4.7 多色探针HRM实验结果的Sanger测序验证
        4.7.1 实验部分
        4.7.2 结果
    4.8 多色探针HRM检测方法的重复性验证
        4.8.1 实验部分
        4.8.2 结果
    4.9 标本添加量对多色探针HRM检测的影响
        4.9.1 实验部分
        4.9.2 结果
    4.10 讨论
    4.11 本章小结
第五章 全文总结
    5.1 主要结论
    5.2 前景展望
参考文献
致谢
攻读博士学位期间已发表或在投稿的论文
攻读博士学位期间申请的发明专利



本文编号：3764615