牛胶原蛋白三维载体支架的制备及其与人角膜基质细胞的生物相容性研究

发布时间：2017-05-20 16:08

  本文关键词：牛胶原蛋白三维载体支架的制备及其与人角膜基质细胞的生物相容性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：角膜是位于眼球最前端的一层透明薄膜组织,在保护眼球、提供屈光力和保障视功能方面发挥了重要功能。热烫伤、化学烧伤、机械损伤以及病菌感染等所造成的角膜病,是仅次于白内障的第二大致盲眼病。虽然角膜移植是治疗角膜病盲的唯一有效手段,但由于捐献角膜严重匮乏,导致绝大多数患者无法通过角膜移植恢复视力,而体外构建的组织工程角膜作为理想的捐献角膜替代品,是目前解决供体角膜匮乏的根本途径。在组织工程角膜的体外构建研究中,载体支架起关键作用,能够为种子细胞提供结构支撑并起到模板作用以引导组织再生和控制组织结构。用于构建组织工程角膜的支架材料主要有异种角膜基质等天然材料、人工合成高分子材料以及胶原和壳聚糖等生物大分子复合材料。与其它支架材料相比,胶原在生物相容性、免疫原性、可降解性等方面均具有明显的优势。鉴于重组人胶原蛋白价格昂贵等问题,在一定程度上限制了利用胶原蛋白制备组织工程角膜载体支架的研发和应用。而牛胶原蛋白来源丰富,提纯方法简便且得率高,在胶原蛋白三维载体支架的制备和推广应用方面日益表现出良好的前景。但到目前为止,仍未见到有关提取和纯化牛胶原蛋白以及利用牛胶原蛋白制备组织工程角膜载体支架及其生物相容性的研究报道。本文以牛肌腱为材料提取牛胶原蛋白,然后利用牛胶原蛋白(130 mg/mL),采用冻干法制成支架冻干片,再以化学交联剂EDC/NHS进行交联,然后对其理化性质和组织结构进行检测。结果显示交联剂比例EDC:NHS=4.125:1时制备的支架表面平整,厚度均匀；光学透明度高,透光率为41.5%-89.6%(WL=300 nm-800 nm);含水量约83.66%士1.75%；机械性能较好：载体支架结构较致密,且形成多孔的片层结构。以上结果显示,该方法制备的牛胶原蛋白载体支架在光学透明度、含水量和组织结构方面均与天然角膜相似,保证了后续探索实验的开展。本文对来源于本实验室自主建立的人角膜基质细胞系的第68代人角膜基质细胞(HCSC)进行体外培养和鉴定。结果显示体外培养的HCSC呈现典型的纤维样,增殖旺盛,群体倍增时间为39.03 h；细胞染色体组型正常；免疫细胞化学法检测HCSC标志蛋白(波形蛋白)和功能蛋白(间隙连接蛋白43、整联蛋白、乙醛脱氢酶3A1)均阳性表达：实时定量PCR显示HCSC能够正常表达生长相关因子(Kras、mTOR和STAT3)、增殖相关因子(p27、CDK2)以及标志蛋白(vimentin)。综合以上结果表明HCSC保持了HCSC的特性,且具有生长增殖的能力和发挥正常功能的潜力,可用于牛胶原蛋白载体支架生物相容性的相关研究。本文利用该HCSC对上述载体支架的生物相容性进行检测。结果显示载体支架浸提液对HCSC无明显毒性作用；将HCSC接种在载体支架上培养5d,细胞能黏附在支架上生长,且有少量细胞迁入到支架内部,细胞能够阳性表达标志蛋白(波形蛋白)和功能蛋白(间隙连接蛋白43、整联蛋白、乙醛脱氢酶3A1),以及生长相关因子(Kras、mTOR和STAT3)、增殖相关因子(p27、CDK2)和标志蛋白(vimentin)。以上结果表明制备的牛胶原蛋白载体支架具有理想的生物相容性。综上所述,本文利用牛胶原蛋白制备了角膜载体支架,该支架的理化性质和组织结构与天然角膜相似,且具有理想的生物相容性。这些结果表明牛胶原蛋白作为组织工程角膜支架材料具有良好的应用前景,同时也为组织工程角膜的体外构建研究奠定了理论基础。
【关键词】：组织工程角膜 载体支架 牛胶原蛋白 人角膜基质细胞 生物相容性
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 文献综述13-21
• 1 角膜的结构与功能13-16
• 1.1 角膜结构13-15
• 1.1.1 角膜上皮层13-14
• 1.1.2 角膜内皮层14
• 1.1.3 角膜基质层14-15
• 1.2 角膜功能15-16
• 1.2.1 保护功能15
• 1.2.2 光的传播功能15-16
• 2 角膜组织工程概述16-21
• 2.1 角膜上皮层的构建17-18
• 2.2 角膜基质层的构建18-19
• 2.3 角膜内皮层的构建19
• 2.4 种子细胞19-21
• 第二章 牛胶原蛋白载体支架的制备和鉴定21-33
• 1 实验仪器和材料21-24
• 1.1 实验仪器21
• 1.2 实验材料与试剂21-22
• 1.2.1 实验材料21
• 1.2.2 实验试剂21-22
• 1.3 主要溶液配制22-24
• 1.3.1 PBS缓冲液配制22
• 1.3.2 交联剂22
• 1.3.3 D-Hanks平衡盐溶液22
• 1.3.4 生理盐水配制22-23
• 1.3.5 伊红染液配制23
• 1.3.6 0.1 M的HCl溶液23
• 1.3.7 甲醛明胶溶液23
• 1.3.8 HE染色所需溶液23-24
• 2 实验方法24-27
• 2.1 牛胶原蛋白提取24
• 2.2 牛胶原蛋白电泳检测24-25
• 2.3 牛胶原蛋白载体支架的制备25
• 2.4 牛胶原蛋白载体支架的检测25-26
• 2.4.1 透明度观察25
• 2.4.2 透光率检测25
• 2.4.3 含水量25-26
• 2.4.4 机械性能检测26
• 2.5 牛胶原蛋白载体支架组织结构检测26-27
• 2.5.1 牛胶原蛋白载体支架冰冻切片与HE染色26
• 2.5.2 超微结构26-27
• 3 实验结果27-31
• 3.1 牛胶原蛋白电泳检测结果27
• 3.2 牛胶原蛋白载体支架的理化性质27-30
• 3.2.1 外观观察27-28
• 3.2.2 透光率28-29
• 3.2.3 含水量29
• 3.2.4 机械性能29-30
• 3.3 牛胶原蛋白载体支架的组织结构30-31
• 3.3.1 牛胶原蛋白载体支架的HE染色结果30
• 3.3.2 超微结构观察结果30-31
• 4 讨论31-32
• 5 本章小结32-33
• 第三章 人角膜基质细胞的培养与鉴定33-48
• 1 材料与用品33-35
• 1.1 实验材料33
• 1.2 实验仪器33-34
• 1.3 实验试剂34
• 1.4 主要溶液配制34-35
• 1.4.1 DMEM/F12(1：1)培养液的配制34-35
• 1.4.2 D-Hanks平衡盐溶液35
• 1.4.3 0.25 %胰蛋白酶35
• 1.4.4 磷酸缓冲液35
• 1.4.5 吉姆萨染液35
• 2 实验方法35-41
• 2.1 人角膜细胞的体外扩增培养35-36
• 2.2 人角膜基质细胞的增殖特性分析36
• 2.3 人角膜细胞的核型分析36-37
• 2.4 人角膜基质细胞免疫化学检测37-38
• 2.5 HCSC实时荧光定量PCR检测38-41
• 2.5.1 总RNA提取38-39
• 2.5.2 cDNA的合成39
• 2.5.3 PCR引物设计39-40
• 2.5.4 引物特异性验证40
• 2.5.5 Real-time PCR扩增40-41
• 3 实验结果41-44
• 3.1 人角膜基质细胞的传代培养及形态观察41
• 3.2 人角膜基质细胞的增殖特性分析41-42
• 3.3 人角膜基质细胞的染色体组型分析42-43
• 3.4 人角膜基质细胞标志及功能蛋白表达43
• 3.5 人角膜基质细胞生长、增殖等相关因子表达情况43-44
• 3.5.1 提取得到的总RNA质量检测结果43-44
• 3.5.2 引物特异性检测44
• 4 讨论44-46
• 5 本章小结46-48
• 第四章 牛胶原蛋白三维载体支架与人角膜基质细胞48-63
• 1 实验仪器与材料48-51
• 1.1 实验材料48
• 1.2 实验仪器48-49
• 1.3 实验试剂49
• 1.4 主要溶液配制方法49-51
• 1.4.1 0.1 mol/L磷酸氢二钠水溶液49-50
• 1.4.2 PBS缓冲液50
• 1.4.3 甲醛明胶溶液50
• 1.4.4 20 %蔗糖溶液50
• 1.4.5 伊红-苏木精染色所用溶液50-51
• 2 实验方法51-55
• 2.1 牛胶原蛋白载体支架的灭菌处理51
• 2.2 人角膜基质细胞的DiI标记51
• 2.3 人角膜基质细胞的接种和体外培养51-52
• 2.4 胶原蛋白载体支架的生物相容性检测52-55
• 2.4.1 载体支架浸提液对HCSC活力影响作用分析52-53
• 2.4.2 人角膜基质细胞与支架复合物的DiI荧光观察53
• 2.4.3 人角膜基质细胞与载体支架复合物的HE染色53
• 2.4.4 人角膜基质细胞与载体支架复合物的超微结构观察53
• 2.4.5 人角膜基质细胞与载体支架复合物的免疫荧光检测53-54
• 2.4.6 人角膜基质细胞与载体支架复合物的实时定量PCR检测54-55
• 3 结果55-61
• 3.1 浸提液法检测结果55-57
• 3.1.1 细胞形态学评价55-56
• 3.1.2 增殖能力检测结果56-57
• 3.2 HE染色与荧光观察57-58
• 3.3 免疫组织化学检测58
• 3.4 超微结构观察58-59
• 3.5 载体支架中HCSC生长和增殖相关因子表达59-61
• 3.5.1 总RNA检测结果59
• 3.5.2 引物特异性检测结果59-60
• 3.5.3 实时荧光定量PCR60-61
• 4 讨论61-62
• 5 本章小结62-63
• 全文总结63-64
• 参考文献64-69
• 致谢69-70
• 个人简历70
• 在学期间发表的学术论文及专利70

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