物理法制备的人脐带细胞外基质和人软骨细胞外基质的理化特性及其对种子细胞的扩增和表型维持的实验研究

发布时间：2017-05-22 17:19

  本文关键词：物理法制备的人脐带细胞外基质和人软骨细胞外基质的理化特性及其对种子细胞的扩增和表型维持的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：实验目的:比较物理法和物理化学法制备脱细胞人软骨细胞外基质（humanarticular cartilage extracellular matrix，hACECM）的差异。通过筛选出的方法制备脱细胞人脐带细胞外基质（the human umbilical cord Wharton’s jelly extracellularmatrix, hWJECM）纳米材料和支架。观察hWJECM膜和hACECM膜对兔软骨种子细胞增殖和表型的影响。实验方法:用DNAGAG定量，羟脯氨酸定量，细胞增殖和细胞毒性检测等方法来并比较物理法和物理化学法制备的人软骨细胞外基质。用MTT法测定这两种ECM对小鼠成纤维细胞的增殖反应以及这两种ECM的细胞毒性，最后选择了物理法作为本课题后续试验的脱细胞方法。将物理法制作的hACECM和hWJECM，配制成0.5%的浆料，分别铺于6孔细胞培养板和96孔细胞培养板，形成1mm厚的薄膜，以此培养板培养兔关节软骨细胞，为实验组（包括hACECM实验组和hWJECM实验组）；空白对照组培养板不经过任何处理，仅使用单纯培养液培养兔关节软骨细胞。通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色，DNAGAG定量，羟脯氨酸定量，原子力学显微镜检测铺板后ECM的状态。分别于第5，10，15天，通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色，DNAGAG定量，羟脯氨酸定量来评估兔软骨细胞接种在两种ECM膜上的生长形态、细胞表型维持和增殖情况。用CCK8法测试软骨细胞的增殖反应，来比较各组在第1、3、7、10天的增殖情况。 实验结果:通过hochest33258染色发现差速梯度离心的hWJECM和hACECM脱细胞完全。脱细胞后的hWJECM和hACECM的甲苯胺蓝染色和番红O染色证实两种ECM里面含有大量的糖胺聚糖。扫描电镜可以发现两种ECM膜都有很多胶原纤维，hACECM的纤维排列平行，而hWJECM的排列杂乱。脱细胞后的hWJECM和hACECM的DNAGAG定量、羟脯氨酸定量同天然的人软骨相比，脱细胞后DNA的量明显少于脱细胞前（P0.05）。hWJECM和hACECM保留了大量的GAG和胶原。原子力学显微镜检测发现，铺板后的hWJECM的高度达500nm，hACECM高度达200nm，显示两种ECM都有很好的拓扑结构，应该会更适合软骨细胞的粘附。兔软骨种子细胞接种在铺有两种ECM的培养板上。倒置显微镜观察hWJECM组和hACECM组的兔软骨细胞在5，10，15天的细胞增殖情况明显好于空白对照组，15天的甲苯胺蓝染色的结果证实hWJECM组细胞数量明显多于其他两个组，CCK8细胞增殖试验第7，10天显示hWJECM组在细胞增殖方面明显地优于空白对照组（p=0.0001； p=0.0006）。CCK-8细胞增殖试验显示第7,10天hACECM组在细胞增殖方面明显地优于单纯培养液的对照组（P=0.02980.05，P0.05）。培养于ECM10,15天的软骨细胞，DNA含量均明显高于空白对照组。培养于hACECM的又高于hWJECM的软骨细胞。 结论:物理法脱细胞能够很彻底的脱去细胞及其碎片，并且很大程度的保留GAG和胶原。其细胞相容性优于物理化学法。这两种ECM对于软骨细胞扩增有很好的促进作用。因此，能很好地替代人软骨ECM作为组织工程软骨支架材料。人脐带ECM制成支架，其生物力学特性是否优于人软骨ECM，，以及材料中GAG含量，胶原的类型和含量与其产生的生物力学强度关系，有待进一步研究。
【关键词】：脐带 软骨 支架 Wharton胶 细胞外基质 软骨细胞 增殖 表型 脱细胞
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08;R687
【目录】：

• 缩略语4-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-14
• 实验一 优选脱细胞制备细胞外基质的方法14-27
• 一 目的14
• 二 实验材料14-17
• 2.1 主要仪器和设备14-15
• 2.2 主要材料和试剂15-16
• 2.3 主要试剂的配制16-17
• 三 实验方法17-22
• 3.1 物理法和物理化学法制备人软骨细胞外基质17-19
• 3.2 仿生细胞外基质支架的制备19
• 3.3 检测方法19-22
• 四 结果22-26
• 4.1 DNA 定量22-23
• 4.2 GAG 定量23
• 4.3 细胞增殖反应和细胞毒性的结果23-25
• 4.4 羟脯氨酸定量25-26
• 五 结论26
• 六 讨论26-27
• 实验二 物理法制备的人脐带细胞外基质的检测27-38
• 一 目的27
• 二 实验材料27-29
• 三 实验方法29-33
• 3.1 主要液体的配制29-30
• 3.2 正常人脐带及其 Wharton 胶组织学染色30-32
• 3.3 脱细胞人脐带细胞外基质材料的制备32
• 3.4 脱细胞人脐带细胞外基质的微观结构32
• 3.6 DNA 定量32-33
• 3.7 GAG 定量33
• 3.8 羟脯氨酸定量33
• 五 结果33-37
• 5.1 正常脐带组织的化学成分定性33-35
• 5.2 物理法制备的人脐带细胞外基质的特点35-37
• 六 结论37-38
• 实验三 物理法制备人脐带细胞外基质与人软骨细胞外基质比较38-50
• 一 目的38
• 二 实验方法38-43
• 2.1 主要试剂和仪器38-40
• 2.2 主要液体的配制40-41
• 2.3 样品准备41
• 2.4 检测方法41-43
• 三 结果43-49
• 3.1 hWJECM 和 hACECM 的组织学观察43-44
• 3.2 DNA&GAG 羟脯氨酸定量44-46
• 3.3 两种 ECM 取向支架的 GAG、羟脯氨酸定量检测46
• 3.4 人脐带细胞外基质支架的吸水率46-47
• 3.5 人脐带 WJECM 支架的生物力学性能47-49
• 四 结论49-50
• 实验四 兔软骨细胞分别接种在人脐带细胞外基质和人软骨细胞外基质分别包被的培养板的初步实验研究50-68
• 一 目的50
• 二 实验材料50-51
• 三 实验方法51-55
• 3.1 软骨细胞分离、培养和扩增51-52
• 3.2 培养软骨细胞的形态观察与传代52
• 3.3 软骨细胞的鉴定52-53
• 3.4 hWJECM 和 hACECM 的培养板的包被53
• 3.5 实验分组53
• 3.6 培养方法53
• 3.7 光镜观察铺板情况53
• 3.8 扫描电镜观察53-54
• 3.9 原子力学显微镜：54
• 3.10 CCK8 细胞增殖的测定54
• 3.11 光镜观察和组织学染色54
• 3.12 DNA 定量54
• 3.13 GAG 定量54-55
• 3.14 羟脯氨酸定量55
• 四 结果55-65
• 4.1 软骨细胞培养倒置显微镜观察55
• 4.2 传代软骨细胞倒置显微镜下观察55
• 4.3 细胞爬片组织学结果55-57
• 4.4 光镜和电镜下观察两种 ECM 的铺膜57-60
• 4.5 三个实验组的大体观察及组织学染色、电镜结果分析60
• 4.6 DNA、GAG 和羟脯氨酸定量结果分析60-65
• 五 结论65-66
• 六 讨论66-68
• 参考文献68-71
• 文献综述71-84
• 参考文献77-84
• 攻读学位期间发表文章情况84-85
• 致谢85-86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 侯克东;袁玫;张莉;郭全义;彭江;眭翔;赵斌;刘舒云;卢世璧;;人脐带Wharton胶中间充质干细胞体外无支架组织工程软骨的构建[J];中国组织工程研究与临床康复;2010年37期

2 韩爽;卢世璧;刘强;张莉;黄靖香;汪爱媛;刘舒云;赵斌;许文静;郭全义;;自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损[J];中国组织工程研究;2012年19期

3 徐磊;叶朝阳;周燕;谭文松;;体外传代培养兔关节软骨细胞的去分化现象[J];中国组织工程研究;2013年20期

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本文编号：386415