装载经RGD修饰的VEGF165和Ang-1双基因共表达腺病毒载体的丝素多孔支架及其促血管化作用

发布时间：2017-05-24 13:11

  本文关键词：装载经RGD修饰的VEGF165和Ang-1双基因共表达腺病毒载体的丝素多孔支架及其促血管化作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：加快皮肤真皮再生支架的血管化速度,是提高支架的成活率、有效引导真皮再生、修复全层皮肤缺损的关键问题。VEGF165和Ang-1是两种重要的促血管生长因子,联合作用既有利于促进血管的生成,又可以使新生血管获得稳定的结构。本文将RGD修饰的VEGF165和Ang-1双基因共表达腺病毒载体装载在多孔丝素支架内,研究RGD修饰的VEGF165和Ang-1双基因共表达腺病毒对EA.hy926细胞的感染效率;研究装载基因载体的生物活性丝素支架体外对血管内皮细胞的感染以及对鸡胚尿囊膜血管生成的促进作用。进一步,将装载基因载体的丝素支架移植于大鼠的皮肤真皮缺损部位,研究支架内目的基因的原位感染和表达,及其对血管生成、真皮再生的影响。首先,用p Ad.VEGF165-Ang-1和腺病毒骨架质粒p Ad.RGD同源重组得到同源重组质粒p Ad.RGD-VEGF165-Ang-1,将线性化的p Ad.RGD-VEGF165-Ang-1通过Lipofectamine2000转染到QBI-293A包装细胞中得到重组腺病毒Ad.RGD-VEGF165-Ang-1。用感染复数分别为10、20、30、40、50、100、150的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926细胞,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞仪检测结果表明,随着感染复数的增大,荧光表达增强,感染效率增大,当感染复数为50时,感染效率达到81%。其次,用感染复数为50的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染EA.hy926细胞,培养1,3,5,7天。CCK-8检测结果表明Ad.RGD-VEGF165-Ang-1感染细胞有助于促进EA.hy926细胞的增殖。ELISA检测VEGF和Ang-1因子分泌水平,结果表明感染Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的细胞分泌的VEGF165和Ang-1的量显著高于未感染对照组(p0.05),且在7天内,随着时间的延长,这两种生长因子的分泌量增大。将Ad.RGD-VEGF165-Ang-1装载在丝素多孔支架内,扫描电镜观察结果表明腺病毒颗粒均匀的分布在支架内的孔壁上。在装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的丝素多孔支架内接种细胞,荧光显微镜观察丝素多孔支架内的腺病毒能够感染接种的细胞,说明装在丝素支架上的腺病毒能保持感染细胞的活性。将接种细胞的丝素支架用戊二醛固定,扫描电镜观察细胞在丝素支架内的生长情况,可见细胞在支架表面能够充分铺展、增殖。鸡胚尿囊膜实验观察结果表明,装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的丝素多孔支架具有良好的促血管化的能力。进一步,将装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的丝素多孔支架植入SD大鼠的皮肤真皮缺损部位。HE和Masson’s染色进行的组织学观察结果说明,与未装载病毒载体的支架相比,装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的多孔丝素支架移植于SD大鼠的全层皮肤缺损创面后,能显著促进支架内部微血管的生成,促进胶原纤维产生,促进真皮组织再生。免疫组化结果表明装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1的丝素多孔支架移植于大鼠皮肤真皮缺损部位后,创面VEGF165和Ang-1的表达量明显地高;且在14天时表达量到最高峰。CD31、PDGF的表达量都也比未装载病毒载体的支架高,且都在14天时表达量最高。说明,一方面目的基因VEGF165和Ang-1的表达促进了丝素支架内血管的形成;另一方面还刺激创面产生更多的PDGF,有利于创面组织再生。
【关键词】：血管化 丝素支架 血管内皮生长因子 血管生成素 腺病毒载体
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 引言10-19
• 1.1 皮肤真皮再生支架的血管化10
• 1.2 促进支架血管化的途径10-13
• 1.3 基因传递载体13-16
• 1.4 丝素支架在皮肤组织工程中的应用16-17
• 1.5 本文研究的目的和主要内容17-19
• 第二章RGD修饰的VEGF165-Ang-1 双基因共表达重组腺病毒的构建及其对EA.hy926 细胞的感染19-36
• 2.1 材料和方法19-28
• 2.2 结果与讨论28-35
• 2.2.1 同源重组腺病毒质粒构建的鉴定28-30
• 2.2.2 同源重组腺病毒的包装和扩增30-32
• 2.2.3 重组腺病毒的RT-PCR鉴定32-33
• 2.2.4 不同感染剂量的Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 感染EA.hy926 细胞33-35
• 2.3 本章小结35-36
• 第三章 Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 装载于丝素支架内体外感染血管内皮细胞36-50
• 3.1 材料和方法36-40
• 3.2 结果与讨论40-49
• 3.2.1 CCK8 检测细胞增殖40-41
• 3.2.2 细胞培养上清液中VEGF165 和Ang-1 的ELISA检测分析41-43
• 3.2.3 装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 的丝素多孔支架材料的SEM观察43-44
• 3.2.4 支架内的病毒载体感染EA.hy926 细胞的荧光显微镜观察44-46
• 3.2.5 EA.hy926 细胞在丝素支架内生长的SEM观察46-47
• 3.2.6 鸡胚尿囊膜的荧光表达及鸡胚尿囊膜血管形成的观察47-49
• 3.3 本章结论49-50
• 第四章 装载Ad.RGD-VEGF165-Ang-1 的丝素多孔支架促进真皮再生的动物实验50-80
• 4.1 材料与方法50-55
• 4.2 结果与讨论55-79
• 4.2.1 大体观察55-57
• 4.2.2 组织学观察57-64
• 4.2.3 免疫组化64-79
• 4.3 本章结论79-80
• 第五章 结语80-82
• 5.1 全文结论80-81
• 5.2 本文的主要研究结果81
• 5.3 本文的不足之处81
• 5.4 今后进一步的研究计划81-82
• 参考文献82-90
• 攻读硕士学位期间发表的论文90-91
• 致谢91-92

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