基于可控表面的纳米电纺丝技术的软骨细胞表型及其向纤维软骨分化的研究

发布时间：2017-06-23 01:01

  本文关键词：基于可控表面的纳米电纺丝技术的软骨细胞表型及其向纤维软骨分化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：对于损伤的半月板，部分切除、缝合或重新固定在膝关节内部已越来越多的被用于防治半月板撕裂[1-4]。行半月板部分切除术已常见于临床治疗手段，但这种方法却能导致明显的功能缺陷，主要表现在膝关节屈伸肌肌力下降[3,5]。膝关节正常的稳定性、关节部位的承载力量的正常分布都明显的依赖于人体大腿的肌肉力量。[3,5,6]. Hurley通过实验证实行半月板部分切除术后的患者在大腿肌肉力量降低的情况下，早期往往伴随并发骨性关节炎[7,8]。而半月板缝合术有效的保护了关节软骨，从而大体上预防了早期发展的骨退行性变化[9]。 大腿肌肉力量的降低可以通过诱发半月板本体感受器的机械性损伤伴其缝合引起或仅仅是部分半月板切除后引起其力量降低[1,10-13]。通过研究半月板切除术后患者的大腿肌肉表面的肌电图已证实上述观点[14]。运动单位的聚集是由膝关节的本体感觉传入纤维包括半月板受体输入脊髓和脊椎上的中心的活动引起。这种多通道相互协调的概念由Glatthorn等人证实[15]，他指出对于半月板部分切除术后的患者，股四头肌运动单位的数量和聚集频率都发生了紊乱。半月板损伤后膝关节的疼痛会干扰关节部位的稳定性，使得患者在行下肢手术前无法承重。这些因素同样也限制了患者的体力活动，最后，导致了肌肉的快速萎缩，与之相伴的是肌肉力量的降低[5]。膝关节术后的功能完全恢复需要持续几周，尤其是对于行半月板缝合术或重新固定的患者。这种对于活动的限制也使得大腿肌肉力量有所降低。 行半月板切除术后的患者经常能观察到膝关节的不稳定性[12]。激活膝伸肌和屈肌的共同活动的正常模式出现紊乱是引起这一现象的常见原因[17]。保持膝关节的稳定性显著影响着整个机体的稳定性、整体运动的相互协调和大腿肌肉力量的力量和耐力。通过研究分析相同参数下的膝伸肌和膝屈肌在极限负荷下（这是典型的许多患者的活动）的力量关系证实了这一现象[18-21]。 Burkset[22]和Schimmer[23]等人通过研究描述了在行半月板切除术后的患者术后快速恢复正常膝关节功能的一个必要的措施就是引入监督康复，从而术后康复[12,24,25]。另一方面，其他研究人员指出了在早期康复引入这项措施的重要性[4,15]。鲜为人知的是，患者行半月板缝合术或重新固定术后出现的可能相关性的功能降低与监督康复之间的相互联系[4]。对于膝关节损伤行手术治疗的患者，等速肌力检查的结果并不总是与功能评估的分数相关（单侧腿抬高测试，单侧腿跳跃测试）[3,26,27]。 本研究的目的是通过对行膝关节半月板切除术或半月板缝合术的术后患者进行1年随访，对康复持续6个月后的半月板撕裂的膝关节功能进行功能评功。通过分析单侧腿跳跃实验和单侧腿抬高试验的临床检测结果来确定所观察的膝关节的功能效率。通过临床研究的结果建立一种评价治疗半月板损伤术后康复效果的客观的方法。我们假设半月板缝合术能产生更好的术后恢复效果。 目的：对于内侧半月板损伤两种手术方式治疗后的患者进行1年随访,采用同样的康复监督措施,比较二者治疗方式后患者的功能恢复情况。 方法：选择30个病人,经过KOSS分数评价为良好,分成两组,分别为半月板切除术与半月板缝合术两组.通过临床研究膝关节采用单侧腿跳一抬高试验评价膝关节功能。检查后的结果与健康的志愿者两者相互比较。通过临床检测的结果建立评价两种治疗方式比较的客观的方法，比较二者治疗方式后患者的功能恢复情况。 结果：分别比较半月板切除术后与健康的志愿者、半月板缝补术后与健康的志愿者之间的临床功能检测结果，功能试验检测显示患者在半月板切除术后与正常人体之间有着明显区别（P≤0.01），半月板修补术后的患者功能检测与半月板切除术后的患者也不同（P≤0.05）。 结论：结果显示半月板切除术后的患者功能恢复相比半月板修补更差，这意味着术后的康复方法仍需改进。 软骨细胞作为软骨组织在软骨基质中唯一存在的特定的细胞种类，在软骨组织再生与代谢方面起到了重要作用。但是由于软骨组织中缺少血管和神经系统，软骨在自身修复方面存在一定的局限性。针对软骨细胞的重要性和局限性,目前新兴了一种新的概念-生物组织工程学。它将工程学、生命科学和材料学相结合，构建人体组织或器官的功能替代物,从而在体外更精确的模拟生物体内环境并研究其功能。生物组织工程学对于临床医学方面有重要意义，其所构建的生物支架材料可以为特定的细胞模拟体内三维结构支撑，不仅为组织再生提供模板，还可以更好的研究各种影响因子对于组织再生和控制组织结构方面的影响。组织工程利用体外构建带有特定功能的软骨组织再移植入体内的治疗方法，为软骨修复治疗提供了可能。由于软骨细胞在普通的二维培养模式下容易失去表型而向纤维细胞表型分化，失去了软骨的特定功能，因此在体外保持软骨的表型的研究对于临床应用有十分重要的意义。半月板在膝关节内起着重要作用，维持膝关节的稳定性，均衡传导负荷，吸收剪切应力，润滑关节并为其提供营养。半月板为纤维软骨结构,由软骨细胞和胶原纤维基质构成，体内纤维软骨的细胞外基质多成平行排列。体外构建具有功能的纤维软骨具有重要的临床研究意义。 目前在生物组织工程的应用方面，纳米材料正成为一种新的研究趋势，纳米技术的应用也更加被人们所重视。电纺丝在制备纳米纤维材料方面有着特定优势，相比其他技术，它更加简便有效。它是在强电场的环境下将聚合物溶液形成喷流并进行纺丝加工的技术。这门技术所需的制作设备简易，而且也能更高效的控制纺丝的形状和结构从而制备特定物理结构和功能的纺丝制品。由电纺丝技术制备的纺丝纤维表面积大，孔隙率高，，纤维纤度细，这些特点可为细胞的生长提供不同结构的多孔支架，利于特定细胞的生长和增殖。因此电纺丝技术已越来越多的被应用于纳米技术和纳米材料的制备，并在生物组织工程领域起着很重要的作用。 目的：建立一种简易可控的不同电纺丝表面的平台用于软骨细胞的体外培养，并很好的维持软骨细胞的表型，利用平行的纳米电纺丝构建了纤维软骨细胞外基质的模型培养软骨细胞并让其向纤维软骨分化。 方法： 1.大鼠原代软骨细胞的提取 2.制作聚乳酸乙醇酸(Poly-(lactic-co-glycolic) acid, PLGA)纳米纺丝:电压：7.5kV流体速度：8μ l/min。 3.利用了不同表面结构（平行和垂直方向）的纳米电纺丝来研究软骨细胞在纺丝上的形态，行为和功能。平面的玻璃表面作为对照组，软骨细胞在平面玻璃，平行电纺丝，垂直电纺丝3种表面生长7天后，通过免疫荧光染色表征Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达，同时利用实时定量PCR在基因水平上鉴定以上3种基因的表达。 结果： 1.电镜鉴定PLGA纳米电纺丝的直径为：200纳米。 2.软骨细胞在平的玻璃表面生长呈现多角形，在平行电纺丝上细胞生长在纺丝之间，在垂直电纺丝上细胞可长在表面和纺丝之间。 3.免疫荧光染色：软骨细胞在不同的表面生长7天后，在蛋白水平上Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原和蛋白多糖存在差异，其中，在平行纳米电纺丝表面，软骨细胞3种蛋白的表达全部上调，而垂直的纳米电纺丝表面只有Ⅱ型胶原表达上调。 4.基因分析：利用实时定量PCR分析Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原和蛋白多糖3种基因的表达差异，以平面玻璃的表面实验组作对照组，进行相对定量。其中，在平行纳米电纺丝表面，软骨细胞Ⅰ型胶原，Ⅱ型胶原和蛋白多糖3种基因的表达显著上调。 结论： 软骨细胞在平行的纳米电纺丝表面上能提高Ⅱ型胶原与蛋白多糖的表达，同时也能显著提高Ⅰ型胶原的表达，使其在纳米电纺丝表面上更能维持软骨细胞表型，并更易于向纤维软骨分化。而在垂直方向的纳米电纺丝表面并没有对蛋白多糖的表达有促进作用。该研究系统可以为组织工程和组织移植等治疗提供有效的工具和理论基础。
【关键词】：半月板切除术 半月板缝合 单侧腿抬高测试 单侧腿跳跃测试 康复督导 软骨细胞 纳米 电纺丝 纤维软骨 平行
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 论文一 缝合修补术与切除术对于半月板损伤修复后临床功能评价方面的比较8-21
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• （一） 前言13-14
• （二） 材料和方法14-16
• 1. 实验设计14-15
• 1.1 1年随访临床半月板损伤修复患者14
• 1.2 选定受试者的范围14
• 1.3 指导监督术后康复锻炼14-15
• 2. 实验方法15
• 3. 统计学方法15-16
• （三） 结果16-17
• （四） 讨论17
• （五） 结论17-18
• （六） 参考文献18-21
• 论文二 基于可控表面的纳米电纺丝技术的软骨细胞表型及其向纤维软骨分化的研究21-49
• 摘要21-24
• Abstract24-27
• （一） 前言27-29
• （二） 材料和方法29-36
• 1. 材料及试剂29-30
• 1.1 主要试剂29-30
• 1.2 标本来源及用液配制30
• 1.3 主要器材30
• 2. 实验方法30-35
• 2.1 SD 大鼠关节软骨原代细胞的提取30-31
• 2.2 PLGA 电纺丝制作31-32
• 2.3 实验组设置32
• 2.4 免疫荧光技术检测32-33
• 2.5 实时荧光定量 PCR33-35
• 3. 统计学方法35-36
• （三） 结果36-44
• 1. SD 大鼠原代软骨细胞培养与鉴定36
• 2. PLGA 纺丝方法与 PLGA 纳米电纺丝结构鉴定36-37
• 3. 软骨细胞在三种不同的表面生长的形态观察与增殖37-40
• 4. 三种不同表面对于软骨细胞蛋白表达的影响40-43
• 5. 三种不同表面对于软骨细胞基因表达的影响43-44
• （四） 讨论44-46
• （五） 结论46-47
• （六） 参考文献47-49
• 综述49-58
• 参考文献56-58
• 致谢58-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 诸乃彤;张毅;;静电纺丝技术在生物组织工程上的应用[J];天津纺织科技;2009年03期

2 刘竞龙,余斌,高成杰;骨组织工程材料修复骨缺损:大鼠成骨细胞与聚乳酸和聚乙醇酸共聚合物支架联合培养观察[J];中国临床康复;2002年16期

  本文关键词：基于可控表面的纳米电纺丝技术的软骨细胞表型及其向纤维软骨分化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：473502