REDV修饰对脱细胞带瓣静脉支架体外再内皮化的影响

发布时间：2017-07-01 12:00

  本文关键词：REDV修饰对脱细胞带瓣静脉支架体外再内皮化的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的： 构建并移植组织工程化的带瓣静脉，被认为是治疗深静脉瓣膜功能不全的理想方案。前期的工作中，本实验室成功地在体外静态条件下构建了与天然静脉瓣结构相似的组织工程化静脉瓣，体内移植后可在6个月内行使正常生理功能，但，术后6个月以后，瓣膜表面逐渐出现ECs成簇生长、脱落、血栓形成、管腔闭塞而丧失瓣膜的功能。我们初步认为，这种情况的出现，可能与内皮化不完全、ECs与支架材料的黏附力不足、脱细胞过程对支架材料的损伤及变性等因素有关。本课题的目的，是通过加强ECs与支架材料的黏附，探讨提高组织工程化带瓣静脉内皮化程度的方法。 应用多肽——尤其是特异性多肽修饰支架材料表面，作为一种新的促进内皮化的研究策略，越来越得到重视。REDV就是一种能选择性促进ECs/EPCs黏附和扩展的特异性多肽。 本实验拟在制备脱细胞带瓣静脉支架的基础上，摸索并优化PEG桥接KREDVY共价结合修饰脱细胞带瓣静脉支架材料所需各反应步骤的实验条件，并研究REDV修饰对脱细胞带瓣静脉支架体外再内皮化的影响。 研究方法： （1）脱细胞带瓣静脉支架材料的制备：通过H-E染色及透射电镜观察等方法，比较Triton-X100、0.05%胰蛋白酶、和0.25%胰蛋白酶等三种脱细胞方法的效果，选择相对更为合适的方法，制备脱细胞带瓣静脉支架材料。 （2）支架材料巯基化：将脱细胞支架材料浸入分别按1:50、1:25、1:12.5、1:6.25和1:3.125等，五种不同浓度稀释的巯基化试剂SATA溶液中，在反应30min、1h、2h和4h等四个时间点，分别采用DTNB法检测支架材料所交联自由巯基的含量，进而确定SATA最佳的作用浓度和作用时间。 （3）支架PEG化：将巯基化支架材料与过量投入的Mal-PEG-NHS混合反应，在室温反应2h、4h、6h和12h等四个不同时间点，检测支架残余自由巯基的含量，进而确定共价结合Mal-PEG-NHS最佳的反应时间。 （4）共价结合KREDVY：HPLC监测Mal-PEG-NHS与KREDVY的反应效率，选择合适的反应条件。亲和免疫化学染色示踪Biotin，表征能否通过以上反应步骤将K(Biotin)REDVY共价结合至支架材料上。 （5）腔内顺向注射1×107/ml的EPCs单细胞悬液后培养7d，再逆向注射EPCs单细胞悬液后培养7d，两端放开后再培养7d，实现修饰后支架的体外再内皮化。H-E染色、扫描电镜观察瓣膜表面细胞生长的情况，免疫组织化学检测细胞表面VEGF的表达。PEG桥接KREDVY修饰支架为实验组，单纯PEG修饰和未修饰脱细胞支架作为对照组。 （6）利用BOSE ElectroForce5100生物反应器搭建体外灌流环路，给予各组再内皮化后支架30min的恒流量1%β-葡聚糖溶液灌流，流量控制为50ml/min，扫描电镜观察瓣膜表面残留的细胞。 结果： （1）经0.05%胰蛋白酶组脱细胞方法处理后，支架材料中细胞成分祛除较为干净，胶原纤维排列相对更加整齐，且纤维间隙相对适中。 （2）支架巯基化的效果，主要取决于SATA的浓度，而与作用时间的关系不明显；当SATA的浓度提高至按1:12.5稀释时，支架交联的巯基量趋于饱和，稳定于0.05mmol/L水平。 （3）随着与Mal-PEG-NHS的反应时间延长，支架上残余的自由巯基含量持续下降，其中以室温反应12h组巯基量下降最多，由0.043mmol/L水平下降至小于0.01mmol/L水平。 （4）溶剂为5%DMSO+95%PBS，室温反应12h的条件下，Mal-PEG-NHS与KREDVY的反应效率最高。 （5）亲和组织化学染色结果显示共价结合K(Biotin)REDVY组可见内膜面有棕黄色较深染色的区域，证明KREDVY已固定于脱细胞带瓣静脉支架表面。 （6）体外再内皮化后，PEG桥接KREDVY修饰组支架上细胞密度高，分布更均匀，免疫组织化学显示细胞表达VEGF。 （7）按牛顿流体切应力计算公式推算，体外灌流时，支架材料内膜面所受切应力约为2dyne/cm2，近似于生理条件下人体静脉血管壁所受的切应力。灌流后各组细胞均有一定程度脱落，但PEG桥接KREDVY修饰组支架上有更多细胞残留。结论： （1）0.05%胰蛋白酶组脱细胞方法的脱细胞效果最好。 （2）本实验所采用的先巯基化，再共价结合PEG，最后共价结合KREDVY的顺行修饰方法，简单、可行，能将KREDVY共价结合至脱细胞带瓣静脉支架上。 （3）REDV修饰能促进支架材料更好地体外内皮化。 （4）REDV修饰能一定程度地提高细胞抵抗血管壁切应力的能力。
【关键词】：REDV 表面修饰 脱细胞支架 静脉瓣 内皮化
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-14
• 英文缩写表14-15
• 绪言15-20
• 参考文献17-20
• 第一部分 PEG 桥接 REDV 短肽修饰脱细胞带瓣静脉支架及其优化20-37
• 一 前言20-21
• 二 试剂和仪器设备21-23
• （一） 试剂21
• （二） 仪器设备21-22
• （三） 主要试剂的配制22-23
• 三 方法23-27
• （一） 脱细胞带瓣静脉支架的制备23-25
• 1. 绵羊带瓣股静脉的取材及修剪23
• 2. 脱细胞绵羊带瓣静脉的制备23-24
• 3. 脱细胞带瓣静脉支架的鉴定24-25
• （二） 支架材料的修饰及其优化25-27
• 1. 半胱氨酸标准浓度 OD 值曲线的建立25
• 2. 脱细胞支架的巯基化25-26
• 3. 巯基化支架与 Mal-PEG-NHS 的共价结合26
• 4. PEG 化脱细胞支架与 KREDVY 的共价结合26-27
• 5. KREDVY 修饰后支架材料的鉴定27
• 四 统计学分析27-28
• 五 结果28-32
• （一） 脱细胞支架的形态结构28-30
• 1. 大体观察28
• 2. H-E 染色28-29
• 3. 透射电镜29-30
• （二） 支架材料的修饰及其优化30-32
• 1. 脱细胞支架的巯基化30
• 2. 巯基化支架与 Mal-PEG-NHS 的共价结合30-31
• 3. Mal-PEG-NHS 与 KREDVY 的反应31-32
• 4. KREDVY 修饰后脱细胞支架的鉴定32
• 六 讨论32-35
• 1. 脱细胞支架的制备32-33
• 2. 短肽修饰功能化支架材料的考量33
• 3. 支架功能化的方法33-34
• 4. PEG 桥接 REDV 共价结合支架材料的反应条件和参数34-35
• 参考文献35-37
• 第二部分 REDV短肽修饰对脱细胞带瓣静脉支架体外再内皮化的影响37-50
• 一 前言37
• 二 试剂和仪器设备37-39
• （一） 试剂37-38
• （二） 仪器设备38-39
• （三） 主要试剂的配制39
• 三 方法39-44
• （一） 兔骨髓来源 EPCs 的分离、培养、鉴定39-41
• 1. 兔骨髓来源 EPCs 的原代培养39-40
• 2. 兔骨髓来源 EPCs 的传代培养40
• 3. 细胞的冻存与复苏40
• 4. 兔骨髓来源 EPCs 的鉴定40-41
• （二） KREDVY 修饰脱细胞支架的体外再内皮化41-42
• 1. 制备 KREDVY 修饰的脱细胞支架41-42
• 2. 支架材料的体外再内皮化42
• （三） 再内皮化后支架的体外灌流试验42-43
• （四） 内皮化情况的评价43-44
• 1. H-E 染色43
• 2. 免疫组织化学43-44
• 3. 扫描电镜44
• 四 结果44-48
• （一） EPCs 的形态学特性44-45
• （二） 支架材料体外再内皮化后的形态学检测45-47
• （三） 体外灌流试验后的形态学检测47-48
• 五 讨论48-49
• 1. 体外内皮化的方法48
• 2. REDV 修饰对脱细胞带瓣静脉支架材料再内皮化的促进作用48
• 3. REDV 修饰对 ECs 抵抗切应力的保护作用48-49
• 参考文献49-50
• 全文小结50
• 本课题的创新点50
• 本课题的意义50-51
• 综述51-59
• 参考文献55-59
• 在读期间发表文章、基金申请和奖励59-60
• 致谢60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张红霞;翟万银;张红锋;;适用于不同尺寸血管的脱细胞方法研究(英文)[J];华东师范大学学报(自然科学版);2012年04期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 张永珍;组织工程化静脉瓣构建的关键技术[D];第二军医大学;2012年

  本文关键词：REDV修饰对脱细胞带瓣静脉支架体外再内皮化的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：505790