影响碳纳米管免疫安全性因素的研究

发布时间：2017-07-19 11:31

  本文关键词：影响碳纳米管免疫安全性因素的研究

  更多相关文章： 碳纳米管 细胞毒性 T细胞 细胞因子 非暴露式气管滴注

【摘要】：由于独特的空间结构和优良的电热理化性能,碳纳米管(carbon nanotube, CNTs)在电子器件、复合材料及生物医药等众多领域有着广泛的应用前景。目前有关碳纳米管的研究主要着重于它的应用方面,其安全性研究尚处于初级阶段,大多数研究主要局限于肺和巨噬细胞对碳纳米管的反应。由于碳纳米管种类繁多,彼此之间存在很大的差异,而且评价标准也不统一,导致得出的研究结果不尽相同,甚至有些结果完全相反,因此关于碳纳米管的安全性问题有待进一步系统深入地研究。本文主要研究21种不同类别、直径、长度和官能团修饰的CNTs在相同研究条件下对免疫系统的影响。体外实验是将人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)与终浓度分别为25、50、100或200μg/mL的21种CNTs共培养,分别在12h、24h、48h和72h时间点,通过检测LDH的漏出率观察细胞膜的破坏程度、检测细胞内ROS的含量观察孵育后的细胞内的氧化压力,并通过检测孵育24h的细胞培养上清液中细胞因子的浓度观察免疫炎症情况。体外补体消耗实验将正常人新鲜血清与终浓度分别为25、50、100或200μg/mL的21种CNTs共孵育1h后,通过检测血清中补体因子的含量观察补体激活情况及急性炎症反应。体内动物实验中,利用非暴露式气管滴注法向每只小鼠体内注入40-tL(0.5或5mg/mL)的碳纳米管溶液,分别于第1、3和7天从球后静脉丛取血,于滴注7天后,将小鼠安乐死并分别称取小鼠体重及其肺脏和脾脏的重量,计算肺和脾的脏器系数；对左侧肺进行肺泡灌洗,并将右侧部分肺进行组织匀浆,离心取上清,通过ELISA方法测定实验动物血清中的非特异性免疫细胞因子、肺泡灌洗液和肺组织匀浆上清液中的氧化及纤维化因子SOD、MDA、TGF-β、PDGF、IL-1β、TNF-α、IL-6和HYP,以观察各碳纳米管引起的炎症反应的变化及规律。分别于气管滴注后第1、7和28天从球后静脉丛取血,检测血清中补体分子(C1 q、MASP和C3)的含量从而反映小鼠补体的激活情况及激活方式。体外细胞毒性研究结果显示,不论大小、长度、表面修饰和类型,所有的碳纳米管在一定剂量下都对PBMCs表现出了明确的细胞毒性,而小直径的单壁碳纳米管诱导的氧化毒性最高,尽管对细胞膜造成的损伤强度一般。值得注意的是,薄壁碳纳米管较厚壁的细胞毒性更显著,而长度较短的碳纳米管相比更长的CNTs的细胞毒性更显著。碳纳米管的细胞毒性很可能是碳纳米管的细胞内化引起的ROS诱导的氧化应激所致的。体外免疫毒性结果显示,碳纳米管可以引起急性炎症反应、激活补体系统,且呈现剂量-效应关系。在相似的长度下,直径越小,越容易引起强烈的炎症反应,直径较大的多壁碳纳米管可以通过结合MASP显著激活凝集素途径。体内实验我们观察到所有组CNTs作用的小鼠的脏器系数都较对照组有所增加,确认了碳纳米管在体内的免疫原性特性。相同类型、直径和长度下,三种不同修饰的CNTs相比,P-CNTs能引起更严重的肺部炎症,而10mg/kg剂量下CNTs-COOH则能诱发更严重的脾脏炎症,因此,P-CNTs可能导致直接毒性而CNTs-COOH则易于诱导间接免疫毒性。1mg/kg剂量下F-CNTs较P-CNTs表现出引起较低的炎性刺激,表明碳纳米管的功能化能显著降低其肺部炎症；当以10mg/kg剂量给药,F-CNTs包括CNTs-COOH和CNTs-OH诱导促炎性细胞因子的产生,证实碳纳米管和肺部炎症之间呈剂量-效应关系。碳纳米管可降低肺SOD活性,同时增加MDA的量。应用1mg/kg-0量时,P-CNTs显示出更显著效果的氧化应激,而CNTs-OH和CNTs-COOH则在使用10mg/kg剂量时表现出更显著的效果。几乎所有的碳纳米管引起显著的体内炎症反应,显示为IL-1p、IL-6和TNF-a的水平增加,相比CNTs-COOH和CNTs-OH,几乎所有类型的P-CNTs,包括P-SWNTs和P-MWCNTs,气管滴注后会诱导更强烈的免疫反应。P-CNTs和CNTs-COOH显著促进IL-2的分泌。Th2细胞相关的细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)和Th17型细胞因子(IL-17A和IL-22)在体内的产生也可由P-CNTs和CNTs-COOH刺激,此外,CNTs-OH相比P-CNTs引起较弱的细胞因子分泌。补体结果表明,碳纳米管能在短时间内引起补体的激活,且在28天后,补体因子浓度逐渐恢复至正常水平。最小的SWNTs组能诱导巨噬细胞合成补体蛋白,并且对三种单壁碳纳米管诱导合成C3因子的时间的差异取决于他们进入细胞的速率。CNTs的类型、直径、长度和表面修饰官能团都是影响碳纳米管免疫毒性的重要参数。本文全面研究了不同直径、长度和功能化的碳纳米管的细胞毒性和免疫反应,尽管关于CNTs在体外和体内毒性存在不一致性,P-CNTs依旧表现出最显著的免疫原性特性。与此相反,CNTs-COOH表现出较弱的免疫反应,尤其是Thl介导的炎症反应。考虑到碳纳米管用于包括基因／药物载体或疫苗佐剂等的临床应用,不同的CNTs的免疫毒性将作为选择CNTs时的考虑因素。
【关键词】：碳纳米管 细胞毒性 T细胞 细胞因子 非暴露式气管滴注
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;TB383.1
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 第一章 绪论11-27
• 1.1 前言11
• 1.2 碳纳米管及其应用11-16
• 1.2.1 碳纳米管及其特性11-13
• 1.2.2 碳纳米管用于癌症治疗13-15
• 1.2.3 碳纳米管作为生物支架材料15-16
• 1.3 碳纳米管的安全性研究16-21
• 1.3.1 碳纳米管的毒理学途径16-17
• 1.3.2 碳纳米管的安全性评价17
• 1.3.3 碳纳米管的免疫安全性评价17-20
• 1.3.4 影响碳纳米管毒性的因素20-21
• 1.4 课题的提出及研究内容21-22
• 参考文献22-27
• 第二章 碳纳米管的体外细胞毒性和免疫毒性研究27-42
• 2.1 引言27
• 2.2 实验试剂和仪器27-29
• 2.2.1 实验材料27-28
• 2.2.2 碳纳米管种类、分组及部分参数28
• 2.2.3 实验设备及耗材28-29
• 2.3 实验方法29-32
• 2.3.1 CNTs悬液的制备29
• 2.3.2 PBMCs的分离29
• 2.3.3 细胞培养及给药29-30
• 2.3.4 细胞毒性检测30
• 2.3.5 细胞膜损伤的检测30
• 2.3.6 ROS的检测30-31
• 2.3.7 细胞因子的检测31
• 2.3.8 补体消耗试验31-32
• 2.3.9 统计学分析32
• 2.4 实验结果32-39
• 2.4.1 CNTs的表征32
• 2.4.2 CCK-8检测32
• 2.4.3 CNTs对PBMCs的细胞膜损伤32-34
• 2.4.4 CNTs对PBMCs的氧化损伤34-35
• 2.4.5 体外研究细胞因子分泌情况35-38
• 2.4.6 体外补体消耗38-39
• 2.5 讨论和结论39-40
• 参考文献40-42
• 第三章 碳纳米管对Balb/c小鼠的免疫毒性研究42-58
• 3.1 引言42
• 3.2 实验试剂和仪器42-43
• 3.2.1 实验材料42
• 3.2.2 实验设备及耗材42-43
• 3.3 实验方法43-45
• 3.3.1 CNTs悬液的制备43
• 3.3.2 透射电镜样品的制备43
• 3.3.3 气管滴注43
• 3.3.4 小鼠外周血中炎症因子的测量43-44
• 3.3.5 小鼠脏器的获得、肺泡灌洗及肺组织匀浆44
• 3.3.6 小鼠组织匀浆上清中SOD的测量44-45
• 3.3.7 小鼠组织匀浆上清中MDA的测量45
• 3.3.8 小鼠外周血中补体分子的测定45
• 3.4 实验结果45-54
• 3.4.1 小鼠体重状况45-46
• 3.4.2 肺部形态学变化46-47
• 3.4.3 脏器系数的影响47-48
• 3.4.4 局部肺组织的纤维化和炎性反应48-50
• 3.4.5 局部肺组织的氧化应激反应50-51
• 3.4.6 CNTs肺泡灌洗后在体内的炎性反应51-53
• 3.4.7 CNTs对小鼠补体系统的影响53-54
• 3.5 讨论与结论54-56
• 参考文献56-58
• 第四章 多种功能化修饰的多壁碳纳米管对人外周血单个核细胞的毒性研究58-66
• 4.1 引言58
• 4.2 材料与方法58-59
• 4.2.1 实验材料58
• 4.2.2 实验设备及耗材58-59
• 4.3 实验方法59
• 4.4 结果59-63
• 4.4.1 碳纳米管的表征59-60
• 4.4.2 不同表面修饰的MWCNTs对PBMCs的细胞存活率的影响60
• 4.4.3 MWCNTs对PBMCs的细胞膜的损伤60-62
• 4.4.4 MWCNTs对PBMCs内的氧化损伤62-63
• 4.5 讨论与结论63-64
• 参考文献64-66
• 全文总结66-68
• 硕士期间科研成果68-69
• 致谢69

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