基于多种载体的新型固定化蛋白酶的制备和在蛋白质组研究中的应用

发布时间：2017-07-27 07:08

  本文关键词：基于多种载体的新型固定化蛋白酶的制备和在蛋白质组研究中的应用

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【摘要】：近年来，由于发现和验证生物标志物、重要功能蛋白质及药物靶标越来越受到人们的关注，从而使得作为全面分析蛋白质表达变化的有力工具蛋白质组学被广泛应用到多种疾病的研究中。作为目前蛋白质组研究中应用最为广泛的研究策略，“鸟枪法”策略是通过对蛋白质的酶解产物肽段进行分析从而获得相应的蛋白质定性、定量信息。因此，高效、完全的蛋白质酶解便成为该策略中的关键环节。与传统溶液酶解方式相比，固定化酶解可显著降低酶解所需时间，提高样本处理通量，因此在近年来受到广泛重视。 本研究采用原子转移自由基聚合法制备了多种基于聚合物修饰微米、纳米载体的新型固定化酶试剂，实现了胰蛋白酶的高密度、高负载量固定。同时，线性聚合物链可作为三维支架结构，支撑多层蛋白酶固定，提高了酶与蛋白质底物的碰撞几率，从而显著提高了酶解效率和完全性。以标准蛋白质牛血清白蛋白为样本，使用所制备的固定化酶试剂，1min后即可完成酶解，使用质谱鉴定到肽段的氨基酸序列覆盖率超过90%，明显高于溶液酶解或文献报道现有固定化酶试剂的酶解效率。使用酵母菌或腾冲嗜热菌全蛋白提取物为样本，进一步对所使用的微米、纳米，以及具有不同表面性的载体材料进行考察发现，，载体材料的尺度和表面亲疏水性对固定化酶的酶解效率以及底物选择性具有一定影响。所制备固定化酶试剂1-3min的酶解产物鉴定到蛋白质数量均超过同样条件下溶液酶解12h的结果。但使用纳米材料制备的固定化酶试剂，酶解效率明显高于微米载体材料。同时，磁性纳米颗粒相对具有比表面积大，酶负载量多及磁性纳米颗粒通过磁性相对易于从体系中分离等优点。而就表面亲疏水性而言，疏水聚合物（GMA）修饰磁性颗粒固定化酶与亲水聚合物(GMAG)磁性颗粒固定化酶的酶解效率接近，酶解产物中鉴定到的蛋白质数量相仿，但二者鉴定结果间的相互覆盖率不高，说明载体表面性质对固定化酶对蛋白质底物的选择性有一定影响。因此，我们将两种固定化酶混合使用，有效降低载体选择性造成的酶解偏性，结果明显优于两种颗粒单独酶切，明显提高蛋白质和肽段的鉴定数量。
【关键词】：原子转移自由基聚合反应（ATRP） 固定化蛋白酶 磁性纳米颗粒 硅胶填料 蛋白质组
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
【目录】：

• 英文缩写词对照表6-7
• 中文摘要7-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 新型聚合物杂化微米硅胶固定化酶的制备及酶解效率考察14-27
• 1 材料14
• 2 方法14-17
• 3.结果与讨论17-26
• 4 结论26-27
• 第三章 新型聚合物杂化磁性纳米颗粒固定化酶的制备、酶解效率考察及与微米颗粒固定化酶的比较27-39
• 1 材料27
• 2 方法27-30
• 3 结果与讨论30-38
• 4 结论38-39
• 第四章 不同表面性质载体固定化酶酶解效率、完全性以及酶解产物互补性的比较39-49
• 1 材料39-40
• 2 方法40-42
• 3 结果与讨论42-48
• 4 结论48-49
• 参考文献49-54
• 个人简历54
• 硕士期间研究成果54-56
• 致谢56-57
• 综述57-64
• 参考文献62-64

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本文编号：580268