ADSCs复合PRF修复家兔耳软骨缺损的实验研究

发布时间：2017-07-28 14:27

  本文关键词：ADSCs复合PRF修复家兔耳软骨缺损的实验研究

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【摘要】：【背景】 根据国家疾控中心的不完全统计，因疾病和外伤导致的软骨缺损发生率约为1.5%-3%，随着运动意识的提高，以及交通等意外事故的增加，其发生率逐年递增。虽然目前也有许多治疗软骨缺损的方法，如自体软骨移植、异体软骨移植以及人工合成生物材料等，但总是不太理想，要么取材不便，要么不易操作，并且花费太大。组织工程为软骨损伤修复提供了新的选择，操作方便、安全有效、经济实惠的软骨缺损修复方法正在被广泛研究与探索。本课题就是以方便、安全、有效、经济为宗旨，尝试将未诱导的自体或异体ADSCs与PRF复合作为一种软骨修复材料，研究其对家兔耳软骨全层缺损的修复作用，为以后组织工程软骨的进一步研究打下基础。 【目的】 将未诱导的自体或异体脂肪干细胞（ADSCs）与富血小板纤维蛋白（PRF）复合，作为一种全新的软骨修复材料，探讨其对家兔耳软骨全层缺损修复的可行性，并检测其免疫排斥反应。 【方法】 1、采用组织分离培养法从家兔背部脂肪中获取ADSCs进行培养，将获得的细胞进行HE染色、成脂肪及成骨诱导培养，并使用FCM对干细胞分子表型进行鉴定，最后将目标细胞进行大量的体外培养，供移植使用。 2、制备家兔PRF，并与培养的ADSCs复合作为一种软骨缺损修复材料备用。 3、建立软骨缺损动物模型。在家兔耳廓做出一个软骨全层缺损的创伤，使用ADSCs与PRF复合物移植修复，通过大体观察与组织学观察（HE和阿尔新兰染色）的方法观察软骨缺损的修复情况。 4、实验分组。取家兔30只，于每只家兔耳部做4处软骨全层缺损，随机分为6组，A组，作为空白对照；B组植入自体ADSCs；C组植入异体ADSCs；D组植入自体PRF；E组植入自体ADSCs与PRF的复合物；F组植入异体ADSCs与PRF的复合物。分别于术后1月、2月、3月取材，进行大体、HE染色及阿尔新兰染色观察，并使用IPP6.0软件对软骨生成量进行半定量分析。 5、免疫学检测。分别取实验前和实验后1w、2w、4w、3月的家兔全血和血浆，流式细胞仪进行外周血淋巴细胞CD4和CD8亚群的检测，ELISA法测定血浆中IL-2和IL-4的水平。 6、统计学分析。所有数据使用SPSS16.0软件统计分析处理，计量资料以均数±标准差（X±SD）形式表示，多个样本均数比较用方差分析，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α值取双侧0.05. 【结果】 1、该实验分离获取培养的ADSCs形态呈现为长梭形，自我更新和增殖能力强，表达脂肪干细胞特异性的表面抗原CD29，其阳性表达率为（91.2±2.9）%，而CD31阴性表达，表达率为（2.9±1.5）%，且可向成脂和成骨的方向分化，其生物学特性稳定。 2、制备的PRF形态良好，质地韧，，有弹性，易于进行移植实验。 3、动物模型成功建立。大体观察，HE和阿尔新兰染色均显示，模型建立3个月后软骨缺损区无新生软骨形成，表明软骨缺损动物模型成功建立。 4、移植后效果观察结果。大体及组织学观察显示，3月后，A组无新生软骨生成，软骨缺损无修复迹象；B组和C组在缺损区边缘均可见到少量的新生软骨组织，但缺损区仍很明显，与空白对照组相似；D组，大体观察见缺损区有一层膜状物形成，组织学观察见新生软骨组织较多，对缺损有一定的修复作用；E组和F组，可见缺损区被新生软骨组织覆盖，表面光滑，与周围软骨组织融合一致，修复效果最佳。IPP6.0统计结果显示，移植物植入3月后，A组软骨缺损修复率为（1.68±0.17）%， B组为（15.9±0.87）%、C组为（15.4±0.91.）%，D组为（32.0±2.76）%，E组为（87.59±3.21）%、F组为（85.77±4.88）%。SPSS16.0统计分析结果，B组与C组之间（P0.05）、E组与F组之间（P0.05），组间无统计学差异，可以认为自体ADSCs组与异体ADSCs组两组之间的修复效果无差异，自体ADSCs复合PRF组与异体ADSCs复合PRF组两组之间的修复效果无差异；空白对照组、ADSCs组、PRF组、ADSCs复合PRF组，各组间（P0.01）,均有统计学差异，表明四组间修复效果均存在显著性差异。 5、免疫学检测结果显示，异体ADSCs参与的组织修复实验中，实验动物在修复材料植入前与植入后测得的淋巴细胞CD4和CD8亚群、CD4/CD8比值和IL-2、IL-4的值，在不同时间点所测值的变化无统计学差异（P0.05）；HE染色结果同样显示：异体ADSCs植入区的组织中并无淋巴细胞浸润，均表明异体ADSCs的植入没有引起明显的免疫排斥反应。 【结论】 1.该实验培养获取的细胞确为ADSCs，具有自我增殖能力，并有多向分化潜能，可以作为组织工程的种子细胞来源。 2.该实验动物模型易于操作，便于观察，是一种理想的软骨缺损实验动物模型。 3.自体或异体ADSCs复合PRF均能够有效的修复家兔耳软骨全层缺损，且二者的修复效果没有差异。 4.异体ADSCs移植不会引起明显的免疫排斥反应。
【关键词】：异体脂肪干细胞 富血小板纤维蛋白 软骨缺损修复 免疫排斥
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R783.1
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-20
• 实验一 ADSCs 的体外分离、培养及鉴定20-27
• 1 材料20-21
• 2 方法21-24
• 3 结果24-25
• 4 讨论25-27
• 实验二 ADSCs 复合 PRF 在家兔耳软骨区生长分化的实验观察27-32
• 1 材料27
• 2 方法27-29
• 3 结果29
• 4 讨论29-32
• 实验三 ADSCs 复合 PRF 修复家兔耳软骨缺损的实验研究32-46
• 1 材料32
• 2 方法32-35
• 3 结果35-42
• 4 讨论42-46
• 全文总结46-47
• 参考文献47-56
• 附录56-64
• 个人简历和研究成果64-65
• 致谢65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：584516