具有感应、调控尿酸浓度功能的稳定细胞系的筛选与鉴定

发布时间：2017-08-04 16:13

  本文关键词：具有感应、调控尿酸浓度功能的稳定细胞系的筛选与鉴定

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【摘要】：合成生物学是后基因组时代发展迅猛的一门综合性交叉学科,它通过有目的地设计合成新的生物体和改造现有生物体,解决了人类发展面临的若干重大问题,为解决能源、健康及环境等重大问题带来了曙光。在合成生物学的发展历程中,基因回路的设计、构建及应用是重要的成就之一。伴随着合成生物学的长足发展,基因回路的功能逐步走向功能复杂和精细调控,同时不断为人类突破药学、医学、工业乃至农业领域的现有科技水平。尿酸(Uric Acid)是嘌呤氧化后的产物,它的溶解度较小,容易形成针状的尿酸盐晶体。正常情况下,人体内的正常代谢保证尿酸含量处于稳定状态,当血尿酸浓度高于420μM称为高尿酸血症(hyperuricemia)。当体内尿酸滞留过多,会导致人体体液变酸,影响细胞正常功能。因此,高尿酸血症严重危害人类健康,进而引发痛风。目前,药物控制是治疗痛风的主要方法,但这种方法有其明显的局限性:过去,别嘌呤醇药物是治疗痛风的主要选择,它在用药安全上有着显著优势但疗效差强人意;伴随着技术的进步,新型的生物尿酸酶制剂问世,对尿酸浓度的调控能力得到进一步增强,但此类药物容易引起超敏反应和耐药。随着合成生物学的发展,利用合成的基因回路实现细胞内尿酸浓度的稳态控制成为一种新的趋势。有文献报导,耐辐射型球菌R1(Deinococcus radiodurans R1)基因组中,huc R表达Huc R;Huc R是一种转录抑制子,huc O是它的结合位点;Huc R在尿酸的介导下,能够通过与huc O结合或分离,控制、调控huc O下游基因的表达,sm Uox是一种尿酸酶基因,能够表达尿酸酶从而改变尿酸浓度。将sm Uox连入huc O下游,如果环境中的尿酸浓度过高,Huc R与huc O解离,sm Uox表达尿酸酶,降低环境中的尿酸浓度;当该浓度低至某一“临界值”,Huc R重新连接至huc O位点上,抑制sm Uox的表达,从而实现尿酸浓度的稳态控制。在我们前期的研究中,人工优化huc R得到优化后的转录抑制子“m UTs”,串联huc O得到八串联结构“huc O8”,采用瞬时共转染的方式将“m UTs”及“huc O8”瞬时导入细胞,选用分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)作为报告基因,构建了双载体尿酸感应回路;将“m UTs”,“huc O8”以及报告基因整合至单向载体上构建了单载体尿酸感应回路;实验结果表明,两种尿酸感应回路均能够感应培养环境当中尿酸浓度的变化(0-2000μM),并且在一定范围内,不同理论比例的m UTs/huc O8能够影响回路的效果。本研究旨在利用合成生物学的理念构建稳定细胞系,实现回路对尿酸的长期稳定感应。另一方面,在稳定细胞系中实现回路对尿酸的长期稳定的调控,能够迅速调控尿酸浓度至正常生理值范围(90-420μM)。主要研究内容,方法及结果如下:1、构建稳定细胞系p-Huc O8-SEAP-m UTs,通过q PCR检测m UTs的相对表达量。结果显示,稳定细胞系的m UTs相对表达量提高了21.8±2.6倍,而瞬时转染细胞系m UTs相对表达量仅升高了3.7±0.15倍。稳定细胞系经过2、4、6、8、10代培养后m UTs相对表达量可保持在17.64±2.58倍,说明稳定细胞系p-Huc O8-SEAP-m UTs构建成功且稳定性良好;2、检测稳定细胞系在0-800μM尿酸浓度条件下SEAP的相对表达量,结果显示稳定细胞系中SEAP的相对表达量随着尿酸浓度的升高而逐步升高,最高达到对照细胞系的2.8±0.21倍(800μM);在稳定细胞系培养过程中,每隔24h改变环境中的尿酸浓度并检测SEAP相对表达量,结果表明,SEAP的相对表达量能够特异地反映培养环境中尿酸的浓度且可逆性良好。3、在稳定细胞系培养过程中,每隔24 h改变环境中的尿酸浓度(0?800),SEAP相对表达量的检测结果显示,SEAP的相对表达量能够特异地反映培养环境中尿酸的浓度,不受之前环境中尿酸浓度的影响。结果表明,该稳定细胞系可用于尿酸浓度的重复检测,实现了回路在细胞水平上对尿酸的稳态感应。4、选择sm Uox为下游基因,构建载体p-Huc O8-sm Uox-m UTs,瞬时转染Hep G2细胞,构建单载体尿酸调控回路,检测其对培养环境中尿酸浓度的调控作用。结果显示,瞬时转染的细胞对尿酸具有调控作用,能在24 h内将800μM尿酸降至573.06±8.59μM。5、采用p-huc O8-sm Uox,pc DNA3.1/V5-m UTs,共转染Hela细胞,检测其对培养环境中尿酸的调控作用。结果显示,瞬时转染的细胞培养24h后对较高浓度尿酸(600/800μM)具有显著的调控作用,可降低尿酸浓度至(441±0.37/635±1.29μM)但无法将其降至正常生理值范围内。6、以载体p-huc O8-sm Uox为基础,利用慢病毒转染技术构建得到3株稳定细胞系p-Huc O8-sm Uox(C3,D3,D4)。进一步瞬时转染载体p LV-m UTs-m Cherry,考察瞬时转染后稳定株调控尿酸浓度水平的差异。结果显示,瞬时转染后的稳定株Trans-C3相较于稳定株Trans-D3,Trans-D4调控尿酸浓度水平较优,能在24 h内将800μM尿酸调整至395.4±0.37μM,落在正常生理值范围内。
【关键词】：尿酸 稳定细胞系 合成生物学
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318
【目录】：

• 英文缩略词表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-13
• 第一章 前言13-19
• 1.1 合成生物学发展概述13-14
• 1.2 合成生物学在构建基因回路中的进展14-15
• 1.3 基因回路在生物医药领域中发挥重要作用15-16
• 1.4 立题依据及前期研究结果16
• 1.5 拟解决的科学问题16-17
• 1.6 研究思路及方法17
• 1.7 理论意义及实用价值17-19
• 第二章 重组载体p-HucO8-SEAP-mUTs的构建与鉴定19-26
• 2.1 实验材料19-20
• 2.2 方法20-22
• 2.3 结果22-25
• 2.4 小结25-26
• 第三章 稳定细胞系p-HucO8-SEAP-mUTs的构建与鉴定26-34
• 3.1 实验材料26-27
• 3.2 方法27-29
• 3.3 结果29-33
• 3.4 小结33-34
• 第四章 重组载体p-HucO8-smUox-mUTs的构建与瞬时转染34-42
• 4.1 实验材料34-35
• 4.2 方法35-37
• 4.3 结果37-41
• 4.4 小结41-42
• 第五章 双载体尿酸调控回路的构建与鉴定42-47
• 5.1 实验材料42-43
• 5.2 方法43
• 5.3 结果43-46
• 5.4 小结46-47
• 第六章 稳定细胞系回路p-HucO8-smUox的构建47-55
• 6.1 实验材料47-48
• 6.2 方法48-50
• 6.3 结果50-54
• 6.4 小结54-55
• 第七章 调控尿酸浓度稳定株的筛选55-61
• 7.1 实验材料55-56
• 7.2 方法56-57
• 7.3 结果57-60
• 7.4 小结60-61
• 讨论与结论61-63
• 结论61
• 讨论61-63
• 参考文献63-66
• 攻读硕士期间发表文章66-67
• 致谢67

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1 凌婧怡;具有感应、调控尿酸浓度功能的稳定细胞系的筛选与鉴定[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

2 宋青青;不同尿酸浓度对人骨髓间充质干细胞成神经分化的影响[D];青岛大学;2014年

3 田应鸿;纳米粒子增强的近红外SPR尿酸浓度的检测[D];武汉理工大学;2015年

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本文编号：620488