微小RNA-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的实验研究

发布时间：2017-10-09 18:13

  本文关键词：微小RNA-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的实验研究

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【摘要】：研究背景：上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,其起病隐匿,发展迅速,病死率居妇科肿瘤首位。目前,肿瘤细胞减灭术联合以铂类为基础的化疗,使70%的晚期患者初期治疗有效,但随之发生的早期复发、化疗耐药令卵巢癌患者的总生存率无明显改善。化疗耐药的产生是导致卵巢癌患者预后不良的重要原因。因此,探讨卵巢癌耐药的相关因素及机制,寻找有效的逆转卵巢癌耐药的治疗靶点,在卵巢癌治疗中显得愈发重要和紧迫。肿瘤的化疗耐药机制非常复杂,顺铂耐药的可能机制包括药代动力学因素(与药物暴露和肿瘤血管相关)、微环境因素(与对细胞周期的影响和细胞外凋亡信号相关)和细胞因素(包括耐药相关蛋白表达的变化、药物靶点突变、细胞修复系统的增强和细胞凋亡的减弱等)。这些途径的关键基因在遗传学及表观遗传学水平的变异可以导致肿瘤细胞耐药现象的发生。已有大量研究表明微小RNA是这些关键基因的调节方式之一。微小RNA (microRNA, miRNA, miR)是一组约22个核苷酸的内源性表达的非编码小RNA,其通过与mRNA 3,端非翻译区碱基互补配对,调控靶基因的表达。微小RNA-100作为一种有潜能的肿瘤相关微小RNA已经被报导与肿瘤的发生、发展及抗药性有关。本课题组前期研究分析98例上皮性卵巢癌患者的miR-100的表达及其与临床病理因素的关系,发现miR-100与卵巢癌的临床分期、转移、化疗后复发及预后呈负相关。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和Polo样激酶1 (polo-like kinase 1, PLK1)是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员,参与细胞增殖、代谢、转移等生物学过程。已有研究表明mTOR和PLK1同为miR-100的靶分子,肿瘤细胞中miR-100的过度表达能够明显抑制mTOR及PLK1的表达从而调控肿瘤细胞的生长、转移及对化疗的敏感性。Feng等研究发现在肺腺细胞癌中,下调miR-100可以激活其靶蛋因PLK1,从而促进肺腺细胞癌对紫杉醇耐药性的形成。Zhu等报导在软骨肉瘤细胞系中miR-100通过靶向mTOR-3'-UTR并抑制其表达,从而增加软骨肉瘤细胞系对顺铂的敏感性。也有文献报导miR-100与卵巢癌耐药的关系,表明miR-100可增加卵巢透明细胞癌细胞系对依维莫司的敏感性。但miR-100与上皮性卵巢癌顺铂耐药的关系目前尚不清楚。本实验拟在前期工作的基础上,通过检测miR-100在人上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP及其亲本细胞株SKOV3中的表达差异,探究miR-100与人上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的关系；通过上下调SKOV3/DDP中miR-100的表达以进一步研究miR-100对上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的调控作用及相关机制；构建人上皮性卵巢癌裸鼠顺铂耐药移植瘤模型,研究miR-100对上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤顺铂耐药的逆转作用,并初步探讨其逆转作用机制。通过本研究为深入探讨卵巢癌耐药机制和克服耐药奠定理论基础,为耐药性卵巢癌的基因治疗提供实验依据。第一章MiR-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的体外实验研究第一节MiR-100与上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的关系研究目的：对SKOV3/DDP细胞及其亲本细胞顺铂IC5o及miR-100表达进行检测,初步探讨miR-100与上皮性卵巢癌顺铂耐药的关系；并通过瞬转构建上下调miR-100的上皮性卵巢癌细胞模型,探讨miR-100对上皮性卵巢癌顺铂耐药的调控作用。方法：1.细胞培养SKOV3及SKOV3/DDP在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,5%CO2、37℃饱和湿度培养箱内培养,贴壁生长。2.细胞瞬转取对数生长的SKOV3/DDP细胞,以3.5×105 个/孔接种于6孔板培养,汇合率达60-70%,取miR-100类似物(mimics)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照.片段(NC、inhibitor NC)各100pmol分别与脂质体lipofectamine 2000 5μL混合,按lipofectamine 2000试剂盒操作说明书进行转染。转染后24h可进行实时定量PCR及CCK8实验检测。3.实时荧光定量PCR检测各组细胞miR-100的表达(1)提取总RNA：使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA； (2)反转录反应：miR-100的逆转录引物为茎环结构引物,以U6基因作为内参。 (3)实时荧光定量PCR反应：取反转录产物分别进行miR-100、U6的PCR反应,并设3个复孔。4.CCK8法检测各组细胞顺铂IC5o取对数生长状态良好的细胞,分别接种于96孔板,3×103个细胞/孔,次日,加入终浓度分别为2、4、8、16、32、64μg/ml的顺铂,每组细胞设无药物组为对照组,每个浓度设5个复孔。孵育48h后每孔力10μl CCK8,继续培养4h,在酶标仪上选择450nm波长测定各孔吸光度(A)并计算平均值。计算各组细胞生长抑制率,顺铂的半数抑制浓度(IC50)。5.利用SPSS 20.0软件对数据进行处理,计量资料用x±s表示,两组间比较采用成组t检验,多组间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), P0.05认为差异有统计学意义。结果：1. SKOV3/DDP细胞的顺铂耐药指数SKOV3/DDP细胞的IC50为8.29μg/mL, SKOV3细胞的IC50为3.72μg/mL, SKOV3/DD P细胞的耐药指数(RI)为2.23。2.各组卵巢癌细胞中miR-100的表达MiR-100在SKOV3/DDP细胞中呈低表达,与SKOV3细胞相比表达水平下降25倍(P0.001)。转染miR-100 mimices后,SKOV3/DDP细胞中miR-100的表达量与NC组相比上升38.29倍,差异有统计学意义(P0.01)；转染miR-100inhibitor后, SKOV3/DDP细胞中miR-100的表达量较inhibitor NC组下降97.7%,差异有统计学意义(P0.001)。3.瞬转后SKOV3/DDP细胞顺铂IC50的变化SKOV3/DDP细胞的存活率随顺铂浓度的增加而降低。转染miR-100 mimices后,SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性增加,其IC50明显低于NC组,差异有统计学意义(P0.001)。转染miR-100 inhibitor后,SKOV3/DDP细胞顺铂IC50明显高于inhibitor NC组,差异有统计学意义(P0.001)。结论：1. SKOV3/DDP具有耐药性,且稳定传代,可进行后续实验研究。2. MiR-100在人上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV3/DDP中呈低表达,miR-100与上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药相关,且miR-100可上调上皮性卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。第二节MiR-100调控上皮性卵巢癌细胞对顺铂敏感性的相关机制研究目的：利用慢病毒表达载体,构建稳定上下调miR-100的上皮性卵巢癌细胞模型,探讨miR-100调控上皮性卵巢癌细胞对顺铂敏感性的相关机制。方法：1.慢病毒感染SKOV3/DDP细胞将LV-miR-100、LV-anti-100及LV-NC三种慢病毒分别感染SKOV3/DDP细胞,12h后移去病毒液,加入完全培养基,继续培养48h,可于荧光显微镜下观察感染效率并qRT-PCR验证。用含2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基继续培养2周,得到稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞。2.实时荧光定量PCR检测慢病毒感染后SKOV3/DDP细胞中miR-100的表达分别提取三种慢病毒感染后SKOV3/DDP细胞的总RNA,实时荧光定量嚣PCR检测miR-100的表达水平,大量扩增并冻存稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及对照细胞,用于后续实验研究。3.生长曲线实验(CCK8法)检测miR-100对SKOV3/DDP细胞增殖状态的影响收集稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及对照细胞,以2×103个细胞／孔分别接种96孔板中,每组设5个复孔,每板分别于12h、24h、36h、48h72h加入CCK8 10μL,继续常规培养2h,以空白对照孔调零,置酶标仪检测各孔吸光度(A),并最终绘制每组细胞生长曲线。4.平板克隆形成实验检测miR-100对SKOV3/DDP细胞增殖状态的影响收集稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及对照细胞,分别接种于6孔板,1×102个细胞／孔,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养14天,甲醇固定,再用0.1%的结晶紫染色。样本进行拍照,然后计数可见细胞克隆数。5.流式细胞仪检测miR-100对SKOV3/DDP细胞早期凋亡的影响培养稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及对照细胞,加入终浓度3μg/ml的顺铂,培养48h后用无EDTA的胰酶收集细胞。使用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测法检测细胞早期凋亡率。6.流式细胞仪检测miR-100对SKOV3/DDP细胞细胞周期分布的影响收集稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及对照细胞,预冷PBS洗涤细胞两次,加入70%预冷酒精,4℃固定过夜,用含RnaseA酶的PI染色,流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期。7.蛋白印迹法检测miR-100对SKOV3/DDP细胞中mTOR蛋白和PLK1蛋白的调节作用分别提取各组细胞中的总蛋白,蛋白上样,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜封闭,一抗孵育1h,二抗孵育1h,用增强化学发光(ECL)试剂盒显色。应用Quantity One软件分析各条带的灰度值,计算mTOR蛋白和PLKl蛋白的表达水平。实验重复3次。8.利用SPSS 20.0软件对数据进行处理,计量资料用x±s表示,两组间比较采用成组t检验,多组间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), P0.05认为差异有统计学意义。结果：1.成功构建稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞模型。荧光显微镜下观察慢病毒感染后的SKOV3/DDP细胞,可见GFP+细胞表达率均90%。实时荧光定量PCR检测慢病毒感染后的SKOV3/DDP细胞中miR-100的表达水平,结果显示感染LV-miR-100后 SKOV3/DDP细胞中miR-100的表达量明显高于感染LV-NC组(P0.05)；而感染LV-anti-100后SKOV3/DDP细胞中miR-100的表达量明显低于感染LV-NC组(P0.01)。2.生长曲线实验(CCK8法)检钡miR-100对SKOV3/DDP细胞增殖状态的影响感染LV-miR-100后SKOV3/DDP细胞增长较感染LV-NC后明显减慢；感染LV-anti-100后SKO V3/DDP细胞增长明显快于感染LV-NC组。3.平板克隆形成实验检测miR-100对SKOV3/DDP细胞增殖状态的影响感染LV-miR-100的SKOV3/DDP细胞克隆数明显少于感染LV-NC细胞克隆数的(P0.05),而感染LV-anti-100的SKOV3/DDP细胞克隆数明显多于感染LV-NC细胞克隆数(P0.05)。4.流式细胞仪检测miR-100对于SKOV3/DDP细胞早期凋亡的影响3μg/ml顺铂作用48h后,感染LV-miR-100的SKOV3/DDP细胞早期凋亡率明显高于感染LV-NC细胞早期凋亡率(P0.01),而感染LV-anti-100的SKOV3/DDP细胞早期凋亡率明显低于感染LV-NC细胞早期凋亡率(P0.05)。5.流式细胞仪检测miR-100对SKOV3/DDP细胞细胞周期分布的影响感染LV-miR-100后SKOV3/DDP细胞G1期细胞比例较感染LV-NC细胞显著升高(P0.01),S期细胞比例却明显低于感染LV-NC细胞的S期细胞比例(P0.01)。相反,感染LV-anti-100的细胞G1期细胞比例较感染LV-NC细胞显著降低(P0.05),S期细胞比例却明显高于感染LV-NC细胞的S期细胞比例(P0.05)。6.蛋白印迹法检测miR-100对SKOV3/DDP细胞中mTOR蛋白和PLK1蛋白的调节作用对各组蛋白光密度值进行采集分析,以GAPDH作为内参照。与SKOV3细胞相比,耐药细胞株SKOV3/DDP细胞中mTOR蛋白及PLK1蛋白的表达水平明显升高(P0.05)。感染LV-miR-100后SKOV3/DDP细胞中的mmTOR蛋白及PLK1蛋白较感染LV-NC组明显降低(P0.05)；感染LV-anti-100后SKOV3/DDP细胞中的mTOR蛋白及PLK1蛋白表达较感染LV-NC组明显增加(P0.05)。结论：1.通过慢病毒感染成功构建稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及阴性对照细胞模型。2.过表达miR-100可抑制SKOV3/DDP细胞增殖,阻止SKOV3/DDP细胞由G1期向S期转换及加速SKOV3/DDP细胞凋亡；而降低SKOV3/DDP中miR-100的表达则可促进细胞增殖,促使细胞由G1期向S期转换以及抑制细胞凋亡。同时,在SKOV3/DDP中miR-100可下调mTOR及PLK1蛋白表达。这些效应均可能为miR-100增加上皮性卵巢癌细胞对顺铂的敏感性的相关机制。第二章MiR-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的体内实验研究目的：构建人上皮性卵巢癌裸鼠顺铂耐药移植瘤模型,通过体内实验探讨miR-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的作用及相关机制。方法：1.构建人上皮性卵巢癌裸鼠顺铂耐药移植瘤模型选取9只4-5周龄雌性BALB/c-nu/n裸鼠为实验的对象,每组3只,分别取对数生长的稳定上下调miR-100的SKOV3/DDP细胞及阴性对照细胞,调整细胞密度5×107/mL,200μL/只行裸鼠肩胛部皮下注射。2.腹腔注射顺铂治疗裸鼠皮下移植瘤并观察其生长情况裸鼠皮下注射三种细胞后,分为3组：LV-miR-100组,LV-anti-100组和LV-NC组。待皮下肿瘤直径约5mm行腹腔内注射顺铂4mg/kg,3d给药1次,共注射7次。每3d测量皮下移植瘤的大小,绘制生长曲线,移植瘤体积V=axb2/2(mm3)。结束治疗后3d处死裸鼠,摘除移植瘤组织。3.免疫组化法检测各组皮下移植瘤中mTOR及PLK1蛋白的表达免疫组化检测各组裸鼠皮下移植瘤组织中]mTOR及PLK1蛋白的表达情况。将免疫组化的结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野,按细胞染色强弱及阳性细胞数进行评分。4.利用SPSS 20.0软件对数据进行处理,计量资料用x±s表示,多组间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),P0.05认为差异有统计学意义。结果：1.构建人上皮性卵巢癌裸鼠顺铂耐药移植瘤模型。接种细胞后3d左右皮丘消失,7d左右皮下移植瘤长出,皮下成瘤率100%。2.顺铂治疗后各组皮下移植瘤生长情况顺铂治疗期间miR-100高表达的裸鼠皮下移植瘤较对照组移植瘤生长缓慢,移植瘤体积较小；相反,miR-100低表达的裸鼠皮下移植瘤较对照组移植瘤生长快速,移植瘤体积更大。统计分析各组间裸鼠皮下移植瘤体积之间的差异,结果显示顺铂治疗后的第15d、18d、21d LV-miR-100组皮下移植瘤的体积要明显小于LV-NC组皮下移植瘤体积(P0.05),而LV-anti-100组皮下移植瘤的体积明显大于LV-NC组皮下移植瘤体积(P0.01)。3.免疫组化法检测各组皮下移植瘤中mTOR及PLKl蛋白的表达与LV-NC组移植瘤相比,LV-miR-100组移植瘤中mTOR及PLK1的表达量下降,而]LV-anti-100组移植瘤中的mTOR及PLKl的表达量增高。结论：MiR-100可有效逆转裸鼠上皮性卵巢癌皮下移植瘤顺铂耐药,其机制之一可能是下调了mTOR及PLK1蛋白的表达。
【关键词】：微RNAs 卵巢肿瘤 顺铂 抗药性 mTOR PLK1
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-30
• 参考文献27-30
• 第一章 MIR-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的体外实验研究30-63
• 第一节 MIR-100与上皮性卵巢癌细胞顺铂耐药的关系研究30-41
• 一、目的30
• 二、材料与方法30-37
• 三、结果37-41
• 第二节 MIR-100调控上皮性卵巢癌细胞对顺铂敏感性的相关机制研究41-58
• 一、目的41
• 二、材料与方法41-50
• 三、结果50-58
• 讨论58-60
• 结论60
• 参考文献60-63
• 第二章 MIR-100逆转上皮性卵巢癌顺铂耐药的体内实验研究63-73
• 一、目的63
• 二、材料与方法63-66
• 三、结果66-69
• 四、讨论69-71
• 五、结论71
• 参考文献71-73
• 全文小结73-74
• 综述74-81
• 参考文献78-81
• 攻读学位期间成果81-82
• 致谢82-83

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本文编号：1001652