Elongator对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制研究

发布时间：2017-10-10 14:00

  本文关键词：Elongator对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其机制研究

  更多相关文章： Elp3 Elp4 迁移 侵袭

【摘要】：目的:通过研究Elp3过表达和Elp3干扰表达的HepG2细胞株以及Elp4过表达和Elp4干扰表达的HepG2细胞株的迁移侵袭能力的改变,探讨Elp3和Elp4对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响及其分子机制。方法:1.鉴定Elp3干扰质粒GV248-Elp3i和Elp4干扰质粒GV248-Elp4i,以及Elp3过表达质粒pFLAG-CMV4-Elp3o和Elp4过表达质粒p FLAG-CMV4-Elp4o。2.确定肝癌细胞HepG2的Puror和G418药物筛选浓度。3.转染干扰质粒后的Hep G2细胞经Puror筛选得到Elp3稳定干扰细胞株和Elp4稳定干扰细胞株;转染过表达质粒后的HepG2细胞经G418筛选得到Elp3过表达稳定细胞株和Elp4过表达稳定细胞株。4.通过RT-PCR、Real-time PCR和Western blot鉴定各组细胞株中外源质粒的整合,检测Elp3和Elp4的mRNA和蛋白表达水平。5.划痕实验,Transwell侵袭迁移实验检测各细胞株迁移和侵袭能力的改变。6.Real-time PCR检测各细胞株中MMP-2、MMP-9和Paxillin的mRNA表达水平。7.Western blot检测各细胞株中PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9和Paxillin的蛋白表达水平。8.Western blot检测瞬时转染不同剂量Elp3过表达质粒pFLAG-CMV4-Elp3o、Elp4过表达质粒pFLAG-CMV4-Elp4o、Elp3干扰质粒GV248-Elp3i和Elp4干扰质粒GV248-Elp4i的细胞株中PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达水平。9.通过Western blot检测PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表达水平确定肝癌细胞HepG2的PI3K/AKT途径抑制剂LY294002的浓度。10.划痕实验,Transwell侵袭迁移实验检测抑制剂LY294002处理后的各细胞株迁移和侵袭能力的改变。11.real-timepcr检测抑制剂ly294002处理后的各细胞株中mmp-2和mmp-9的mrna表达水平。12.westernblot检测抑制剂ly294002处理后的各细胞株中pi3k、akt、p-akt、mmp-2和mmp-9的蛋白表达水平。结果:1.质粒经双酶切鉴定,成功检测到elp3过表达质粒:pflag-cmv4-elp3o中1601bp的重组elp3条带;elp4过表达质粒:pflag-cmv4-elp4o中1613bp的重组elp4条带;elp3干扰质粒:gv248-elp3i中44bp的shrna条带;elp4干扰质粒:gv248-elp4i中44bp的shrna条带。2.hepg2细胞于含不同浓度g418或puror的培养基中培养14天后,得出50ng/μl为puror药物筛选浓度,600ng/μl为g418药物筛选浓度。3.hepg2细胞转染各组质粒24h后,加入g418或puror筛选14天,经单克隆挑取和单克隆扩大培养及鉴定,得到目标细胞株。4.划痕实验和transwell实验证明了elp3和elp4过表达能促进肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力,干扰elp3和elp4则抑制肝癌细胞的迁移和侵袭能力。5.real-timepcr检测发现elp3和elp4过表达能增加肝癌细胞中的mmp-2、mmp-9和paxillin的mrna表达水平,干扰elp3和elp4则抑制肝癌细胞中的mmp-2、mmp-9和paxillin的mrna表达水平6.westernblot检测各细胞株中发现elp3和elp4过表达能增加肝癌细胞中p-akt、mmp-2、mmp-9和paxillin的蛋白表达水平,干扰elp3和elp4则抑制肝癌细胞中的p-akt、mmp-2、mmp-9和paxillin的蛋白表达水平。7.westernblot检测瞬时转染不同剂量elp3过表达质粒pflag-cmv4-elp3o、elp4过表达质粒pflag-cmv4-elp4o、elp3干扰质粒gv248-elp3i和elp4干扰质粒gv248-elp4i的细胞株中pi3k、akt和p-akt的蛋白表达水平,得出elp3和elp4的表达量与akt磷酸化水平两者间存在剂量效应。8.划痕实验,transwell侵袭迁移实验检测,加入抑制剂ly294002处理后,能抑制各细胞株迁移和侵袭能力。9.Real-time PCR检测抑制剂LY294002处理后,HepG2细胞株、Elp3过表达细胞株和Elp4过表达细胞株中MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平降低,Elp3干扰细胞株和Elp4干扰细胞株中MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平没有明显变化。10.Western blot检测抑制剂LY294002处理后的各细胞株中p-AKT、MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平均降低。结论:1.Elp3和Elp4过表达可以促进肝癌细胞的迁移和侵袭,而干扰Elp3和Elp4表达可以抑制这一现象。2.Elp3和Elp4可以通过PI3K/AKT途径来调节肝癌细胞的迁移和侵袭。
【关键词】：Elp3 Elp4 迁移 侵袭
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 第一部分 稳定干扰ELP3和ELP4细胞株的构建15-38
• 1 材料与方法15-28
• 1.1 材料15-16
• 1.2 主要仪器设备16-17
• 1.3 实验方法17-28
• 2 实验结果28-35
• 2.1 Elp3和Elp4干扰载体的构建以及最佳靶位点的筛选28-30
• 2.2 Elp3干扰质粒和Elp4干扰质粒的鉴定30-31
• 2.3 稳定转染细胞株的筛选31-33
• 2.4 稳定转染细胞株的鉴定33-35
• 3 讨论35-38
• 第二部分 ELP3和ELP4对肝癌细胞迁移和侵袭的影响及其分子机制的研究38-77
• 1 材料与方法38-50
• 1.1 材料38-39
• 1.2 主要仪器设备39-40
• 1.3 实验方法40-50
• 2 实验结果50-73
• 2.1 划痕实验测定Elp3和Elp4对肝癌细胞迁移的影响50-53
• 2.2 Transwell实验检测Elp3和Elp4对肝癌细胞迁移和侵袭的影响53-55
• 2.3 检测Elp3和Elp4对肝癌细胞内基质金属蛋白酶表达量的影响55-57
• 2.4 Elp3和Elp4对肝癌细胞内PI3K/AKT途径的影响57-58
• 2.5 Elp3和Elp4对AKT磷酸化的剂量效应58-62
• 2.6 抑制剂LY294002对AKT磷酸化的剂量效应62-63
• 2.7 LY294002抑制Elp3和Elp4对肝癌细胞迁移的促进作用63-65
• 2.8 LY294002抑制Elp3和Elp4对肝癌细胞迁移和侵袭的促进作用65-67
• 2.9 检测LY294002对肝癌细胞内Elp3、Elp4以及MMPs表达量的影响67-70
• 2.10 LY294002抑制Elp3和Elp4对肝癌细胞内PI3K/AKT途径的影响70-72
• 2.11 Elp3 和 Elp4 对肝癌细胞内 FAK/Paxillin 途径的影响72-73
• 3 讨论73-77
• 结论77-78
• 参考文献78-85
• 综述：肿瘤转移与AKT激活作用85-100
• 参考文献93-100
• 展望100-101
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文101-102
• 本文受以下基金资助102-103
• 缩略词表103-104
• 致谢104-105

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本文编号：1006738