氯化钴对Walker256细胞HSP90的表达及其抑制剂17-AAG对细胞凋亡和生长影响

发布时间：2017-10-11 18:24

  本文关键词：氯化钴对Walker256细胞HSP90的表达及其抑制剂17-AAG对细胞凋亡和生长影响

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【摘要】：目的观察氯化钻(CoCl2)在体外模拟低氧对肝癌Walker256细胞形态的改变及增殖能力的影响,进一步确立合适的肝癌Walker256细胞的体外缺氧模型。并在该缺氧模型基础上观察不同程度缺氧对肝癌Walker256细胞中HSP90蛋白的表达能力的影响,并探讨可能的影响机制。方法1.倒置显微镜法观察不同浓度的CoCl2 (0、50、100、200、300、500nmol/L)和不同浓度的17-AAG (0、0.1、0.25、0.5、1.2μmol/L)分别处理肝癌Walker256细胞48h后,观察其细胞形态的改变。2.MTT法测定不同浓度COCl2 (0、50、100、200、300、500timol/L)和不同浓度的17-AAG抑制剂(0、0.1、0.25、0.5、1.2μmol/L)分别经不同的时间段处理肝癌Walker256细胞,来检测其增殖能力的影响。3.蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别检测不同浓度的CoCl2 (0、50、100、200、300、 500μmol/L)和0.5μmol/L 17-AAG作用于Walker256细胞后,对细胞中HSP90及Bcl-2表达的影响。4.Annexin- FITC/PI流式细胞双染技术检测17-AAG对肝癌Walker256细胞的凋亡的影响。5.用Walker256细胞的细胞悬液建立大鼠种植瘤模型,并将成瘤实验大鼠分为经腹腔给予17-AAG和不给予17-AAG两组(各组15只大鼠),观测比较两组大鼠种植瘤的平均体积。结果1.不同浓度的CoCl2对细胞具有一定程度的增殖抑制作用。300μmol/L和500μmol/L CoCl2作用于细胞,镜下观察可见大量细胞碎片,细胞膜出现明显的皱缩。Western Blot结果显示CoCl2处理细胞48h后,能够上调HSP90的表达,该作用具有浓度依赖性。2.不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG对Walker256细胞的增殖抑制作用具有时间和剂量的依赖性。17-AAG对细胞形态也有影响,对照组Walker256细胞饱满呈圆形,胞质丰富,大小均一,包膜完整,而经17-AAG作用48 h后的Walker256细胞则明显减少,细胞边缘模糊、形态差,部分细胞包膜破裂。Annexin-FITC/PI染色法检测分析结果显示：①与常氧组相比低氧组细胞凋亡比率无明显差异(P0.05)；②与常氧组相比较17-AAG+常氧组细胞凋亡比率增加(P0.05)；③与低氧组相比17-AAG+低氧组细胞凋亡比率增加(P0.05)；④与17-AAG+低氧组相比17-AAG+常氧组细胞凋亡比率增加((P0.05)。同时通过Wester Blot检测分析结果显示：①与常氧组相比,低氧组的HSP90和Bcl-2表达增强(P0.05)；②与常氧组相比,17-AAG+常氧组的HSP90和Bcl-2表达受到抑制(P0.05)；③与低氧组相比,17-AAG+低氧组的HSP90和Bcl-2表达也受到抑制(P0.05)；④17-AAG+低氧组与17-AAG+常氧组相比,HSP90和Bcl-2的表达差异均无统计学意义(P0.05)。3.17-AAG抑制剂能够明显抑制大鼠种植瘤的生长,随着给药时间的延长,发现给药组大鼠种植瘤生长较对照组明显缓慢,对照组大鼠种瘤平均体积始终呈增长的趋势。结论1.不同浓度的CoCl2能诱导HSP90的表达,当CoCI2在200μmol/L的剂量时诱导作用最为明显。2.HSP90抑制剂17-AAG能够明显抑制大鼠种植瘤的生长。3.HSP90抑制剂17-AAG能够明显的促进细胞凋亡的发生,因而推测其机制可能是17-AAG与HSP90结合后,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,从而使肿瘤凋亡明显增加。
【关键词】：低氧 Walker256细胞 HSP90 HSP90抑制剂17-AAG
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 英文缩略词表10-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-23
• 1. 材料试剂与主要的仪器设备15-17
• 1.1 实验材料与仪器15
• 1.2 主要的试剂与抗体15-16
• 1.3 主要的实验仪器16
• 1.4 试剂的配制16-17
• 2. 细胞的处理17-18
• 2.1 细胞的复苏17-18
• 2.2 细胞的换液与传代18
• 2.3 细胞的冻存18
• 3. MTT法测定细胞增殖能力的影响18-19
• 3.1 实验分组18-19
• 3.2 实验步骤19
• 3.3 倒置显微镜观察细胞形态19
• 4. Western Blot检测分析19-22
• 4.1 细胞总蛋白的提取19-20
• 4.2 细胞总蛋白含量的测定(BCA法)20
• 4.3 灌胶与上样20-21
• 4.4 电泳21
• 4.5 转膜21
• 4.6 免疫反应21
• 4.7 显影、定影21-22
• 4.8 凝胶图像分析22
• 5. 细胞凋亡观察与检测22
• 6. 大鼠种植瘤模型的建立22
• 7. 统计学分析22-23
• 结果23-33
• 1. 氯化钴对细胞形态学的影响23-24
• 2. 氯化钴对细胞增殖能力的变化24-25
• 3. 低氧环境下CoCl_2诱导HSP90的表达25-26
• 4. HSP90抑制剂17-AAG对细胞的增殖抑制作用26-27
• 5. 17-AAG对Walker256细胞形态的影响27-28
• 6. 低氧环境下17-AAG对Walker256细胞凋亡的影响28-30
• 7. 17-AAG对Walker256细胞HSP90和Bcl-2蛋白表达的影响30-31
• 8. 大鼠种植瘤模型的建立31
• 9. 给予17-AAG后对照组和给药组大鼠肿瘤的生长情况31-33
• 讨论33-38
• 1. HSP90基因结构与功能33-34
• 2. HSP90在肿瘤中的作用34-35
• 3. 低氧可诱导HSP90的表达35
• 4. HSP90抑制剂17-AAG的作用及干预实验35-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 综述：热休克蛋白90与恶性肿瘤的研究进展42-50
• 1、HSP90的结构及生物学特性42
• 2、HSP90的功能42-43
• 3、HSP90与肿瘤的关系43
• 4、HSP90与肿瘤耐药性43-44
• 5、HSP90在肿瘤治疗中的应用44-46
• 6、展望46-47
• 参考文献47-50
• 攻读学位期间发表的学术论文目录50-51
• 致谢51-52

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本文编号：1013984